IL2 IFNγ GMCSF表达质粒对cDNA3MDCVP1 DNA疫苗的增强作用.docx

河北医科大学 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学 位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 承担相应的法律责任。 研究生签锯寸 名： ：劬歹为 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导F进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰 写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写， 文责自负。 研究一：锵新躲彰科 萨，月z垆日 中文摘要l 中文摘要 l L-2、I FN-Y、GM-CSF表达质粒对 pcDNA3／MDC—VPl DNA疫苗的增强作用 摘 要 目的：柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type3，CVB3)是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体。VPl 是CVB3主要的衣壳蛋白，具有较强的免疫原性，可刺激 机体产生保护性的中和抗体，但已有的国内外研究表明，编 码VPl的DNA疫苗免疫小鼠后虽可诱导机体产生中和抗 体，但效价较低，不能有效阻止致死量CVB3感染。因此如 何增强VPl基因的免疫原性，提高免疫保护作用是目前亟 待解决的问题，也是我室近几年的研究重点。国内外许多研 究表明，联合应用细胞因子可通过不同的环节调节和增强 DNA免疫效应，发挥佐剂作用。 目前发现，粒一巨噬细胞集落刺激因(GM—CSF)能激 活单核巨噬细胞和中性粒细胞，有较强的免疫增强剂的作 用，尤其是诱导树突状细胞成熟和功能性分布的作用已受到 广泛注意，由于它可以通过促进包括树突状细胞(DCs)在内 的抗原递呈细胞(APC)的增殖分化，将其吸引到注射部位，增 强抗原提呈能力，从而达到增强免疫效果的作用，所以有可能 被应用于免疫治疗中诱导抗原提呈细胞。鉴于GM．CSF有明 显增强免疫和免疫调节作用，本研究构建了GM。CSF真核表 达质粒。又因我室曾成功构建过pcDNA3／VPl．hIL．2和 pcDNA3／mIFN吖重组质粒，结果表明二者均在一定程度上增 强了CVB3 VPl DNA疫苗的免疫保护作用。故选用了对体 中文摘要液和细胞免疫应答均有上调作用的IL．2和同样能对多种细 中文摘要 液和细胞免疫应答均有上调作用的IL．2和同样能对多种细 胞产生上调和诱导MHC I类及II类分子作用的IFN吖的表 达质粒作比较。将这三种质粒分别与pcDNA3／MDC—VPl 融合基因DNA疫苗联合应用共同免疫小鼠，通过免疫小鼠 后诱生的特异性免疫应答和病毒攻击后的免疫保护作用来 观察接种后的免疫效果并比较它们对疫苗的免疫增强作用。 方法：(1)利用pORF9．mGMCSFv26质粒，用自行设计 的mGM．CSF特异性引物进行PCR扩增；(2)将扩增产物与 pGEM—T载体连接，转化DH5cz大肠杆菌，筛选重组子，提 取质粒进行酶切鉴定和测序；(3)取双酶切的mGM．CSF片段 与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接，经过转化、筛 选和酶切鉴定后， 构建真核表达重组质粒 pcDNA3／mGM．CSF；(4)用碱裂解法从转化的DH5 Q 大肠杆菌中大量提质粒取pcDNA3／mGM．CSF、 pcDNA3／mlFN吖、pcDNA3／hIL一2、pcDNA3／MDC—VP 1和 pcDNA3，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化；(5)动物 实验：将4～6周龄雄性BALB／c小鼠随机分为9组，每 组lO只；9组分别为生理盐水对照组、空质粒对照组 (pcDNA3组)、pcDNA3／MDC．VP 1对照组、pcDNA3／hIL一2 对照组、pcDNA3／mIFN．Y对照组、pcDNA3／mGM．CSF对照 组及pcDNA3／MDC．VPl与pcDNA3／hIL一2混合注射组、 pcDNA3／MDC．VP 1与pcDNA3／mIFN．7混合注射组、 pcDNA3／MDC。VP 1与pcDNA3／mGM．CSF混合注射组。纯化 后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次 每只接种1 00pg，每3周免疫1次，共免疫3次；每次 免疫后第2 0天，眼眶静脉取血，分离血清，用微量中和 中文摘要试验(固定病毒．稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中 中文摘要 试验(固定病毒．稀释血清法)检测血清中CVB3特异性中 和抗体。第3次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋 巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒(cell counting kit一8， CCK一8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和