FHL2通过与TGFαEGFR通路互作调控GN细胞增殖.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 华中农业大学2016 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 3．2细胞转染 ．16 3．3细胞加药处理 ．16 3．3．1 TGF一0【处理细胞 16 3．3．2通路抑制剂处理细胞 17 3．4细胞计数 ．18 3．5细胞周期检测 ．18 3．6 CCK一8法检测细胞增殖 ．．19 3．7人卵巢颗粒细胞瘤细胞系KGN总RNA的提取 19 3．7．1 RNA的抽提 ．．19 3．7．2 RNA浓度及质量检测 ．．20 3．8 cDNA链反转录合成 2l 3．8．1 cDNA第一链合成 2l 3．8．2 cDNA的浓度检测 2l 3．9引物设计 ．2l 3．10 QRT-PCR．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 22 3．11人卵巢颗粒细胞瘤细胞系KGN总蛋白提取和Western Blot实验 ．．23 3．11．1蛋白的提取 ．23 3．11．2蛋白浓度检测及制样 ．24 3．11．3蛋白免疫印迹 ．24 3．12实验设计 26 3．12．1 FHL2影响卵巢颗粒细胞的生长 26 3．12．2 TGF一0【对KGN细胞增殖的影响及调控FHL2的表达 27 3．12．3 TGF一0l调控FHL2作用的相关信号通路探究 一27 3．13数据分析 28 4实验结果 29 4．1 FHL2对卵巢颗粒细胞的调控作用 29 4．1．1 si—FHL2干扰效果检测 ．29 4．1．2月把2对KGN细胞增殖的影响 30 4．1．3 FHL2对KGN细胞周期的影响 3l Ⅱ 万方数据 FHL2通过与 FHL2通过与TGF—o．／EGFR通路互作调控KGN细胞增殖 4，1．4FHL2对TGF-a、EGFR基因表达的影响 ．32 4．2 TGF一0【对KGN细胞增殖的影响及调控FHL2的表达 33 4，2．1 TGF—a促进KGN细胞增殖 ．33 412．2 TGF-oc促进FHL2的表达 ．33 4．2．3 TGF．0【调控FHL2、EGFR、TGF-a基因的表达 35 4．3 TGF—a调控FHL2基因表达的相关信号通路研究 ．．36 5讨{仑 ．38 5．1 KGN细胞是研究卵巢颗粒细胞功能的良好模型 38 5．2 FHL2对KGN细胞的增殖和周期具有重要调控作用 ，38 5．3 TGF．0【对KGN细胞的调控作用依赖于FHL2的表达量 40 5．4 TGF一0【与FHL2互作共同调控颗粒细胞的增殖 一41 5．5 TGF—Ct调控FHL2相关信号通路探究 ．．42 6总结 ．44 6．1本试验主要结果 一44 6．2本试验创新点 ．44 6-3本试验不足点及下一步计划 ．44 参考文献 45 致谢 ．55 III 万方数据 FHL2通过与 FHL2通过与TGF—a／EGFR通路互作调控KGN细胞增殖 摘要 FHL2(Four and a half LIM domains protein 2)基因是FHL基因家族中研究最多 的一位成员，月也2不仅可以结合不周转录因子调控相关基因表达，而且对于细胞信 号转导通路也有重要调控作用。研究表明FHL2在人卵巢颗粒细胞瘤细胞中表达， 转化生长因子一u(Transforming growth factor-a，TGF．a)可通过P13K／AKT和MAPK 信号通路调控人卵巢颗粒细胞瘤细胞KGN增殖。但FHL2对KGN细胞的调控作用、 TGF．毡与FHL2互作、以及该互作对颗粒细胞的调控作用尚不清楚。本课题以KGN 为模型，对上述问题予以探究。本研究结果将为深入了解卵泡发育和卵泡发育的调 控机制提供新的理论基础，同时为卵泡发育相关信号转导通路提供新的研究思路。 主要研究结果如下： 1．FHL2调控KGN细胞的增殖、周期及TGF．／It的表达 干扰KGN细胞中FHL2的表达后，分别利用CCK-8试剂盒、流式细胞术以及 RT-PCR检测FHL2对细胞增殖、周期的影响以及对TGF—c【的表达调控： 1)CCK．8法检测细胞增殖结果显示，FHL2干扰组细胞存活率(1．00±0．01 VS 0．32±O．05，p0．001)显著降低；细胞计数法检测细胞数量比值发现，FHL2干扰组 细胞数比值显著低于对照组(1．00±O．01 VS 0．44±0．10，pO．05)，表明FHL2 knockdown能够抑制细胞增殖； 2)流式细胞仪检测细胞周期结果显示，干扰FHL2表达后，S期细胞比例显著 降