IL34调控FLS在RA发病制中的作用研究.docx

目 目 录 一、摘要 1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 4 二、正文 7 (一)前言(一)日IJ舌 77 第一部分IL．34在RA血清中的表达及对FLS的作用研究 (二)材料和方法 ．1 1 1．实验对象与材料 ．1 1 2．方法 ．1 4 (三)结果 2 l (四)讨论 ．27 (五)结论 ．3 1 (六)参考文献 32 第二部IL．34促进FLS分泌IL．6促进Thl7数量增加的研究 (二)材料和方法 38 1．实验对象和材料 ．38 2．方法 ．40 (三)结果 44 (四)讨论 49 万方数据 (五)结论 (五)结论 5 3 (六)参考文献 54 第三部分IL-34调控PBMC分泌IL．6促进Thl7数量增加的研究 (二)材料和方法 58 1．实验对象和材料 5 8 2．方法 59 (三)结果 62 (四)讨论 64 (五)结论 67 (六)参考文献 68 三、综述 72 (一)综述 72 (二)参考文献 ．．79 四、攻读学位期间发表文章情况 86 五、致谢 ．87 万方数据 大连医科大学博士学位论文IL．34调控FLS在RA发病机制中的作用研究 大连医科大学博士学位论文 IL．34调控FLS在RA发病机制中的作用研究 博士生姓名： 王冰 指导教师： 李芳教授 指导小组： 李 霞教授 专业名称： 免疫学 摘要 背景：类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属于慢性进展性的自身免疫病， 主要特征是滑膜增生、软骨及骨组织破坏，具体发病机制仍不十分清楚。目前认 为可能与细胞因子网络调节紊乱、滑膜过度增生、侵润及T细胞亚群分化失衡有 关。白细胞介素34(Interleukin 34，IL一34)是2008年发现的一种具有维系巨噬细胞及 树突状细胞生存、发育及活化功能的细胞因子，主要通过与集落刺激因子．1受体 (colony stimulation factor一1 receptor,CSF一1R)结合而发挥作用。类风湿关节炎患者血 清和关节滑液中IL．34的含量均高于正常人，并且与RF及抗CCP抗体呈正相关。 滑膜成纤维细胞(fibroblast—like synoviocytes，FLS)是类风湿关节炎发病中的重要角 色，其表面表达高水平CSF．1R，提示IL一34可能通过与其表面受体结合而调控FLS 的功能，从而参与了疾病的发病过程。 目的：本研究旨在探索IL．34在类风湿关节炎患者发病和进展中所起的作用， 并深入研究IL一34通过调控FLS细胞参与RA发病过程的具体机制。 方法：收集RA患者外周血并分离出血清，酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测RA患者及健康对照血清IL．34水平；评估IL．34 水平与临床各个指标的关系。分离培养RA患者FLS，培养至4～6代利用流式细胞 术鉴定FLS在培养中的纯度，并检测FLS表面IL，34受体(CSF．1R)表达水平；在 分离培养的FLS中加入重组IL．34刺激，蛋白芯片技术检测细胞上清液中不同细 胞因子的分泌；增加FLS细胞株数，反转录PCR(Reverse Transcription，RT-PCR) 及ELISA法验证蛋白芯片结果，检测IL．34刺激前后及加入IL．34受体拮抗剂后细 1 万方数据 大连医科大学博士学位论文胞中IL．6，Cox．2的mRNA表达水平及细胞培养上清的IL．6，PGE2的分泌；提取 大连医科大学博士学位论文 胞中IL．6，Cox．2的mRNA表达水平及细胞培养上清的IL．6，PGE2的分泌；提取 FLS总RNA，RT-PCR检测caspase8 mRNA表达水平，观察IL．34对FLS凋亡的 影响，MTT法检测IL．34刺激后的细胞增殖；提取FLS总蛋白，Western blot检测 FLS胞内Erk．1／2、JNK一1／2／3、P38、NF．1(B通路的活化，并用相应的信号通路抑制 剂处理FLS，加入IL一34刺激后RT-PCR检测细胞中IL．6，Cox．2的mRNA表达水 平，ELISA法检测细胞培养上清的IL．6，PGE2的分泌；体外分离健康人PBMC， 磁珠分选法分离出CD4+T细胞，流式细胞术检测分离后CD4+T细胞百分率，需95％ 以上方可用于实验中；将分离纯化好的CD4+T细胞，与RA患者FLS以直接接触或 transwell体系共培养，体系中加入CD3／CD28或CD3／CD28及IL．34，流式细胞术 检测Thl7百分率；ELISA法检测共培养上清IL．6水平；向RA患者FLS与健康人 外周血分离出的CD4+T细胞共培养体系中加入IL一6受体拮抗剂，流式细胞术检测 Thl7百分率。 结果：RA患者血清中IL．34水