KLF4在TGFβ1诱导血管平滑肌细胞分中的作用及机制研究.docx

IIII I I I[[II III I II II III 目 录 ＼1 807864 中文摘要 1 英文摘要 ·8 英文缩写 1 5 研究论文KLF4在转化生长因子p1诱导血管平滑肌细胞分化中的 作用及机制研究 引言 ·l 6 第一部分TGF-p1诱导VSMC分化与上调KLF4和TpRI表达有关 前言再IJ舌 ·1‘l 8一 材料与方法 20 结果 ·23 附图 ·26 讨论················ ··········· ······················· ······· ·· ········· ········· ··34 小结 ·36 参考文献 37 第二部分TGF—p1通过激活Smad和p38 MAPK信号通路诱导 KLF4磷酸化和KLF4与Smad2／3相互作用 前言剐舌 ．4·ll 材料与方法 42 结果 ·45 附图 一48 讨{仑 ．58 小结 ·59 参考文献 ·60 第三部分KLF4与Smad2协同激活T[3RI启动子的作用机制 前言月O舌 ·63·63 材料与方法 ．64 结果 ·68 附图 73 讨{仑 ·83  小结 84 参考文献 85 综述 88 致谢 j 1 01 个人简历 102  中文摘要 KLF4在转化生长因子B1诱导血管平滑肌细胞 分化中的作用及机制研究 摘 要 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)异常增殖是许 多血管增殖性疾病，如动脉粥样硬化、血管再狭窄、高血压等发生发展的 共同病理学基础。既往研究已经证明，转化生长因子pl(transforming growth factor,TGF．131)作为多肽生长因子家族中的一员，通过与受体 T13RI／T13RII(TGF-p type I receptor，T13RI；TGF—p type II receptor，T13RII) 相互作用而发挥对细胞生长、分化和凋亡的调节作用。阐明TGF．D在 VSMC生物学行为调节中的作用及其机制，对防治血管重塑和逆转增殖性 血管病变具有重要的意义。 KrOppel样因子(krfippel．1ike factor，KLF)是一类含有锌指结构的 转录因子，其典型结构特征是在羧基端具有3个C2H2锌指结构。KLF 广泛参与细胞增殖、凋亡、分化以及胚胎发育等生命活动的调控。近年来 的研究结果显示，KLF4(krnppel．1ike factor 4)作为转录因子既可直接结 合DNA，又能通过与其它转录因子相互作用而调控基因的表达。以往研 究证实，TGF．13 1可诱导KLF4表达并促进体外培养的去分化型VSMC进 行分化，但KLF4在TGF．D诱导VSMC分化中的作用及机制尚不清楚。 为了阐明KLF4在TGF．p诱导VSMC分化中的作用及???分子机制， 本文在系统研究TGF．131对VSMC增殖、分化、迁移、细胞周期等生物学 行为影响的基础上，进一步探讨KLF4在TGF．131促进VSMC分化中的作 用和分子机制。旨在为揭示动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管 疾病的发病机制提供新的实验和理论依据，为心血管疾病的防治提供新的 靶点。 1．TGF．p1诱导VSMC分化与上调KLF4和TIlRI表达有关 本部分实验以VSMC分化和去分化标志基因表达水平作为判断 VSMC表型的指标，检测TGF．131对VSMC表型及相关生物学行为的影 响。为了考察T13RI是否参与TGF．131诱导VSMC分化的过程，一方面， 观察敲减T131U基因表达对VSMC分化和去分化标志基因表达的影响；另  中文摘要 一方面，观察KLF4过表达和敲减对TIBRI表达以及对VSMC分化和去分 化标志基因表达的影响。实验结果如下： 1．1 TGF．B1抑制VSMC增殖、迁移和细胞周期进程 MTT分析、细胞计数、伤口愈合实验结果显示，TGF·p1能以浓度 (O．5、l、2、4 ng／m1)和时间(24、48 h)依赖的方式抑制VSMC增殖 和迁移，以TGF．131浓度为2 ng／ml作用于VSMC 48 h对细胞增殖和迁移 的抑制作用最强。 流式细胞术检测结果显示，TGF．131能以时间(6、12、24、48 h)依 赖的方式抑制VSMC细胞周期的进程。TGF．131(2 ng／m1)刺激VSMC 48 h后，停滞于Go／G1期的细胞数显著增加，同时处于S期和G2／h／[期的细 胞数明显减少。 1．2 TGF．81诱导VSMC分化标志基因SM22a和SM Q—actin表达 SM22a和SM a-actin表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志， PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要标志。采用We