LAM技术检测肉及肉制品中沙门氏菌的分析.docx

摘 要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点，沙门氏菌 病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌 科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。人畜感染后可 呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡 率，或者降低动物的繁殖生产力。为确保食品安全与食品贸易，需要大力加强食 品检验的力度，迫切需要建立快速、灵敏的沙门氏菌的检验方法。 环介导等温扩增(100p．mediated isothermal amplification，简称LAMP)是利用 4条特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高 效、快速地扩增DNA的新技术。该技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确 和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到 了日益广泛的应用。 本研究针对已报道的沙门氏菌(SMmonella)保守的加们基因设计了2对特 异性强的引物，对反应体系中的M92+浓度、dNTP浓度、甜菜碱浓度、反应温度 以及外引物与内引物浓度比进行优化，以确定适宜LAMP反应体系和LAMP扩 增程序，其适宜反应体系为：2．5I-tLloxBst buffer，49LdNTPs混合物，FIP、BIP 引物各49L，F3、B3引物各0．5此，适宜镁离子浓度为2．5mmol／L，1laLBst链 置换聚合酶，4¨L甜菜碱，模板DNA2I-tL，双蒸水2此，总反应体系25 J-tL。63 ℃保温1h，观察反应结果。 比较了LAMP检测肉及肉制品中沙门氏菌的7种模板制备方法，表明FTA 滤膜法可高效从样品中提取沙门氏菌DNA，可有效的消除LAMP反应的抑制因 子，灵敏度高、操作简便、耗时短，该方法明显优于其他方法。比较了LAMP 方法与PCR方法检测人工污染肉制品的检出限，LAMP方法检测沙门氏菌的检 出限为3efu／gL，而PCR法的检出限为300 cfu／}tL，LAMP法的检出限比PCR 法的检出限低100倍，是高效的检测沙门氏菌的方法。 实际检测了48份样品，同时与PCR及国标检测沙门氏菌的方法做了比较， 结果表明：国标法检出率为85．4％，检出时间为5d，PCR方法的检出率为89．5％， 敏感性为100％，特异性为83．8％，符合率为95．8％，检出时间为6h，LAMP方 法的检出率为91．6％，敏感性为100％，特异性为70．O％，符合率为93．8％，检出 时间为1．5h。 本研究成功建立了LAMP检测沙门氏菌的新方法，该方法特异性好、敏感性 高而且节省时间，为食品中致病菌的检测提供了技术平台，为检测机构推广此技 术提供了技术支持。 关键词：LAMP；环介导等温扩增；检测；链置换反应；沙门氏菌；肉及肉制品  Study on Loop—mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Salmonella in Meat Products Author：Wang Yu Supervisor：Professor Zhang Wei Major：Processing and Storage ofAgriculture Products Abstract Food safety emergencies frequently occurred in recent years．Salmonellosis is one of the most significant zoonosis，which is caused by salmonella belonging to intestinal bacteria branch,including bacterium leading to gastroenteritis，typhoid and paratyphoid． Human and animal infectious Can be a silent carrier state，or a lethal state manifesting clinical symptoms．It may increase the rate of mortality or death，or reduce the propagable productivity of animal．To eusure food safety and business，it iS required to establish a rapid，sensitive salmonella testing method in food realm． A novel nucleic acid amplification meth