LKB1AMPKmTOR信号传导通路在非小细胞肺癌细系中的初步研究.docx

天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，其发生机制比 较复杂。如今已普遍认为肿瘤是一种基因疾病，其中癌基因的激活和抑癌基因 的失活协同多种紊乱的信号传导通路在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要 的作用。LKBl，又名STKll基因(serine／threonine protein kinase 11)，是近年来 倍受关注的一个新的抑癌基因。研究显示在绝大多数散发性肿瘤中，LKBl基因 的体细胞突变是罕见的，但在非小细胞肺癌中突变率高达15％．35％，而对于 LKBl功能的信号传导途径目前了解的并不多，Reuben J．Shaw在MEF(小鼠胚 胎成纤维细胞)研究中显示LKBl可以通过磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶 (AMP．activated protein kinase，AMPK)从而激活AMPK，负向调节哺乳动物 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，即 LKBl．AMPK-mTOR信号传导通路，且目前发现mTOR信号通路过度活化与肿 瘤的发生、发展密切相关。本研究选用非小细胞肺癌细胞株(none small cell lung cancel，NSCLC)A549、H460、H1792、H1299、Calul以及遗传背景相同的同 源细胞系H1299．PLKO．1(对照组空载体细胞株)和H1299．LKBl曲RNA(LKBl 基因稳定抑制的细胞株)，通过Western．Blot方法探讨LKBl oAMPK．roTOR信 号通路在非小细胞肺癌中是否可以活化及其机理，为肺癌的靶向治疗提供新的 思路。 方法： 1、培养NSCLC细胞株A549、H460、H1 792、H1 299、Calul以及H1 299一PLKO．1、 H1299．LKBlshRNA，收集并裂解细胞，经Westhen Blot检测不同细胞株中LKBl 的蛋白表达。 2、应用不同浓度的糖代谢抑制剂2．脱氧葡萄糖(2．Deoxyglucose，2-DG)： 5mM、10mM、25mM分别处理H1792、H1299、Calul细胞株，作用2h；同时应 用25raM的2．DG分别处理H1792、H1299、Calul细胞株，作用不同的时间：30min、 1h、2h；应用25mM的2．DG分别处理H1792、H1299、Calul细胞株，作用不同的 时间4h、8h、24h，各自有空白对照，比较LKBl下游靶蛋白AMPK磷酸化 (p-AMPK—a．m172)水平的差异；选取25mM的2．DG分别处理A549、H460、 H1299．PLK0．1、H1299．LKBlshRNA2h，比较AMPK磷酸化水平的差异。 3、选取25mM的2．DG分别处理A549、H460、H1792、H1299、Calul、  天津医科大学硕士学位论文 H1299．PLK0．1、H1299．LKBl5hRNA细胞株，作用2h，比较mTOR下游靶蛋白核 糖体S6蛋白激酶(ribosomal protein S6 kinases，S6K)磷酸化水平(p．S6K．Th?凹) 及真核细胞翻译启始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor 4E binding proteinl，4EBPl)磷酸化水平(p．4EBPl．Ser65)的差异。 4、应用109M的Compound C(AMPK活性抑制剂)预先处理H1792细胞株， 作用30min，然后再应用25mM的2．DG处理细胞2h，比较mTOR下游靶蛋fjS6K、 4EBPl磷酸化水平的差异。 结果： 1、LKBl在H1299、H1792、Calul(LKBl基因野生型细胞株)中存在特 异性表达带；而在A549、H460(LKBl基因突变细胞株)中不表达，LKBl信 号在H1299一PLK0．1细胞中要明显强于LKBl基因稳定抑制的细胞系 H1299一LKBlshRNA。 2、给予2-DG处理后，H1299、H1792、Calul细胞中，2．DG浓度为5mM 时p-AMPK—a-Thrl72即可见升高，随着浓度增加，p-AMPK。Ⅱ．Thrl72渐升高，呈 剂量依赖效应，作用30min即起效，持续时间可达24h；A549、H460细胞中， p-AMPK-a．m172未见升高；H1299．PLK0．1细胞系中可见到p-AMPK．a-Thrl72显 著升高；而H1299一LKBl3hRNA细胞系中p-AMPK．仅．m172则没有明显升高。 3、给予2-DG处理后，H1299、H1792、Calul细胞中可见S6K、4EBPl磷 酸化水平明显降低；A549、H460细胞中未见S6K磷酸化水平明显下调； H1