LPE对王种致龋菌生长及表兄链球菌相关酶活的影响.docx

天津医科大学硕士学位论文中文摘要 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的 牙菌斑生物膜是龋病发生的基础。变异链球菌、表兄链球菌和内氏放线 菌等是构成牙菌斑生物膜的主要致龋菌。细菌通过疏水作用吸附于牙釉质表面 的获得性膜，利用葡糖基转移酶催化基质中的蔗糖合成葡聚糖，葡聚糖可诱导 牙面上细菌的粘附和聚集，促进牙菌斑形成。牙菌斑中的细菌代谢产酸，主要 是无氧酵解中乳酸脱氢酶催化丙酮酸生成乳酸，酸的累积造成牙釉质的局部脱 矿，导致龋损形成。本课题组在国内外首先开展柠檬提取物(Lemon peel extract， LYE)防龋的系列研究，LPE是由水果柠檬中提取的一种淡黄色液体，主要成分是 柠檬烯及其同分异构体(占，营．含量的79％)。本实验通过研究LPE对5种致龋菌(变 异链球菌、血链球菌、表兄链球菌、内氏放线菌、嗜酸乳杆菌)的生长抑制作 用，对表兄链球菌致龋相关酶(葡糖基转移酶、乳酸脱氢酶)的活性及代谢产 物(水不溶性多糖)的抑制作用，探讨LPE抑制口腔致龋菌生长，抑制表兄链球菌 的附着性、代谢产酸的作用机制，同时分析代谢酶在细菌致龋作用中的意义。 方法 1．LPE提取及成分分析 采用水蒸气蒸馏法提取：挥发油，在一定的色谱质谱条件下，测得柠檬挥发 油成分GC—MS总离子流色谱IN(TIC)。根据检索NIST2008谱库，按峰面积归一化 法进行定量，求得各组分的，旧对含量。 2．LPE对五种口腔致龋菌生长的影响 本实验选取变异链球菌、表兄链球菌、嗜酸乳杆菌、血链球菌、内氏放线 菌为实验菌株，采用液体稀释法测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)；根据MIC实验结果，配置含LPE的TPY液体培养基。将菌悬 液(1×108CFU／m1)与TPY液体培养基按体积比1：10比例接种，置于恒温细菌培 养箱中37。C厌氧培养。分别二]C0h、O．5h、lh、2h、4h、6h、18h、24h提取菌液，采 用菌落计数法检测LPE对五种细菌生长的影响。以活菌数(19CFU／m1)为纵坐标， 时问为横坐标，作图绘制生长曲线。 3．LPE对表兄链球菌葡糖基转移酶活性和细胞外不溶性多糖含量的影响 采用二倍稀释法，用TPY液体培养基将LPE稀释为2．25mg／ml、1．125mg／ml、 0．563mg／ml和O．28 lmg／m14个浓度的溶液(MIC为4．5mg／m1)，以TPY液体培 养基作为空白对照组。采用菌落计数法检测MIC以下四个浓度LPE对表兄链球 天津医科大学硕士学位论文菌生长曲线的影响。用Neson．Somogyi法测定培养6h、18h、24h和48h培养液 天津医科大学硕士学位论文 菌生长曲线的影响。用Neson．Somogyi法测定培养6h、18h、24h和48h培养液 中还原糖的含量，计算出葡糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)活性；采用葸 酮法测定水不溶性多糖(Water insoluble glucan，WIG)的含量，并对GTF活性与 WIG含量的关系做相关性分析。 4．LPE对表兄链球菌乳酸脱氢酶活性和产酸的影响 分组设计同上。采用还原性辅酶I氧化法，测定LPE对表兄链球菌乳酸脱氢 酶(Lactate dehydrogenase，LDH)活性的影响，同时用FE20实验室pH计测定用 药前后培养液OOpH值的变化(ApH=初始pH值一终末pH值)，以检钡I]LPE对表 兄链球菌产酸能力的抑制作用，并对LDH活性和细菌代谢产酸能力的关系做相 关性分析。 结果 1．从柠檬提取物气相色谱．质谱总离子流色谱图(TIc)中，共检测出100余个色谱 峰，鉴定了其中的40个色谱峰，其含量占挥发油总量的93．954％。主要成分是 柠檬烯，B．蒎烯，4．皆烯等。 2．LPE对五种口腔致龋菌的MIC分别是：变异链球菌、血链球菌、表兄链球菌 的MIC为4．5mg／ml，嗜酸乳杆菌和内氏放线菌的MIC为2．25mg／ml。在致龋菌 的MIC作用下，从0．5h到2．4h，随作用时间延长，实验组菌量逐渐减少。选取0、 0．5h、1h、2h四个时点，对各菌组的实验组与空白对照组进行重复测量方差分 析，变异链球菌、血链球菌、内氏放线菌、嗜酸乳杆菌、表兄链球菌的实验组 与空白组比较，差异有统计学意义(pD．05)。 3．菌落计数法测量MIC以下四个浓度LPE对表兄链球菌生长的影响。从 0．28lmg／ml幺且至1]2．25mg／ml组，随着LPE溶液浓度的升高，在0h、O．5h、1h、2h、 4h、6h、18h、24h、48h，与空白对照组比较，LPE对表兄链球菌的生长有抑制 作用。在同一时间点，随着I。PE溶液浓度的升高，表兄链球菌的GTF活性及胞外 WIG含量逐渐