MACC1介导乙酰胆碱促人胃癌细胞侵袭及迁移的研究-肿瘤学专毕业论文.docx

硕士学住论文 的表达，并且MACCl在乙酰胆碱促胃癌转移过程中发挥了介导作用。因此本研 究旨在探索乙酰胆碱对人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的影响，阐明M3型胆碱受 体／AMP眦CCl信号通路及其在人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中的作用。 研究假设： 1．乙酰胆碱促进人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT； 2．M3型胆碱受体介导乙酰胆碱促人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的作用； 3．乙酰胆碱作用于M3型胆碱受体后，通过AMPK上调MACCl的表达，且 MACCl在乙酰胆碱促人胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中发挥重要的中间信号作用。 研究内容： 1．筛选M3型胆碱受体高表达的胃癌细胞株 分别提取BGC．803、BGC．823、MGC一803、MKN．28、MKN-45、SGC一7901 人胃癌细胞的RNA，逆转录成cDNA后，实时定量PCR检测各细胞株M3型胆 碱受体的mRNA表达情况，并选取表达量最高的两株细胞进行后续实验。 2．乙酰胆碱对胃癌细胞侵袭／迁移及EMT的影响 将10uM浓度的乙酰胆碱添加到MKN．45及MGC．803胃癌细胞的培养基， 分别培养0 h、24 h及48 h，用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的 Transwell迁移实验分别检测两株细胞的侵袭及迁移能力；同样再以10uM浓度 的乙酰胆碱刺激MKN．45及MGC．803细胞0 h、24 h及48 h，各提取全部mRNA 和蛋白质，将mRNA逆转录成cDNA，实时定量PCR检测EMT相关指标(E． 钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9)的mRNA相对表达量，用 Western blot的方法检测上述EMT指标的蛋白含量。我们也观察了乙酰胆碱刺激 前后两株细胞的形态变化。 3．M3型胆碱受体抑制剂对乙酰胆碱作用的影响 在MKN．45及MGC．803胃癌细胞的培养基中加入M3型胆碱受体特异性抑 制剂达非那新(10uM浓度)，30 min后再加入10uM的乙酰胆碱，然后两株细 万方数据  摘要 胞培养48 h。实验一共分为四组：阴性对照、乙酰胆碱、达非那新、达非那新+ 乙酰胆碱。用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的Transwell迁移实 验分别检测两株细胞的侵袭及迁移能力。再按照上述分组培养MKN．45及 MGC．803细胞株48 h，各提取两株细胞的mRNA和全蛋白，mRNA逆转录成 cDNA后，实时定量PCR检测EMT相关指标(E．钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋 白、MMP2及MMP9)的mRNA相对表达量，用Western blot方法检测上述EMT 指标的蛋白含量。 4．乙酰胆碱的刺激对MACCl表达的影响 生物信息学的方法分析M3型受体的编码基因CHRM3的表达情况与磷酸化 AMPK的相关性。我们考虑MACCl可能为乙酰胆碱下游信号，将10uM浓度的 乙酰胆碱添加到MKN．45及MGC．803胃癌细胞的培养基，分别培养0 h、24 h 及48 h，各提取全部mRNA和蛋白质，将mRNA逆转录成cDNA，实时定量PCR 检测MACCl的mRNA相对表达量，用Western blot的方法检测MACCl的蛋白 含量。然后将MKN．45及MGC．803胃癌细胞按照阴性对照、乙酰胆碱、达非那 新、达非那新+乙酰胆碱四组培养48 h后，实时定量PCR及Western blot分别检 测MACCl的mRNA及蛋白含量。免疫荧光实验检测乙酰胆碱刺激后MACCl 的核转位情况。 5．MACCl在乙酰胆碱促胃癌细胞侵袭／迁移及EMT中的重要性 将MKN．45及MGC．803细胞转染MACCl的沉默序列(siMACCl)或阴性 对照序列(siCtrl)，实时定量PCR及Western blot分别检测mRNA及蛋白水平 的沉默效果。然后在转染有siMACCl或siCtrl的细胞中加入10uM乙酰胆碱进 行培养，共分成四组：siCtrl、siMACCl、siCtrl+乙酰胆碱、siMACCI+乙酰胆碱。 用带有基质胶的Transwell侵袭实验及不带基质胶的Transwell迁移实验分别检测 两株细胞的侵袭及迁移能力。实时定量PCR及Westem blot分别在mRNA及蛋 白水平检测EMT相关指标(E．钙黏蛋白、波形蛋白、纤连蛋白、MMP2及MMP9) 的变化。 6．验证AMPK是乙酰胆碱／M3型胆碱受体与MACCl的中间信号 IV 万方数据  硕士学位论文 将MKN．45及MGC．803胃癌细胞按照阴性对照、乙酰胆碱、达非那新、达 非那新+乙酰胆碱四组培养48 h后，提取全蛋白，Western blot检测p-AMPK的 蛋白含量。在两株细胞的培养基中加入8uM浓度的AMPK抑制剂Dorsomorphin， 30 min后再加入10u