miR103对牛骨骼卫星细胞分化的影响研究.docx

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：no NO．：120910795 Dissertation for the Master Degree lnfluence of miR．．1IR_ 03 onn tlle Differentiation of Bovine Skelletal Muscle S atellite Cells Candidate：Sun Xiaofeng Supervisor：Professor Yan Yunqin Degree Category：Maser of Science College：School of Life Science First level discipline：Biology Second level discipline：Cell Biology Harbin China June 2015 万方数据 —————————————呈圣一IIYIllllll2lllltl7llUl7lUlllllllll5lllll810H1—— —————————————呈圣一IIYIllllll2lllltl7llUl7lUlllllllll5lllll810H1——曼曼!曼曼曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼舅曼曼曼曼曼曼曼邑曼量曼鼍曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼舅 T Z f， -oo I曼曼曼曼皇鼍曼 一 目 录 中文摘要 ．I 英文摘要 ．．III 1前言 1 1．1骨髂肌的基本结构及其发育调控 ．1 1．2骨骼肌卫星细胞的研究进展 ．3 1．3 microRNA的研究进展概述 4 1．3．1 microRNA的发现 ．4 1．3．2 microRNA的发生 ．4 1．3．3 microRNA调控基因的表达机制 ～5 1．3．4 microRNA的功能 ．．5 1．4骨骼肌发育与microRNA 6 1．5 miR．103的研究进展 ．．7 l，6研究的目的与意义 ．7 2材料与方法 ．9 2．1主要实验材料 9 2．1．1菌株、质粒与细胞 9 2．1．2工具酶、试剂盒和其他试剂 9 2．1．3主要仪器 一9 2。1．4主要试剂的配制 ．1l 2．2实验方法 ．1l 2．2．1细胞总RNA提取和反转录 11 2．2．2细胞基因组DNA的制备 13 2．2．3实时定量PCR 14 2．2．4 pcDNA3．1一miR一103载体的构建 ．．14 2．2．5重组质粒瞬时转染牛骨骼肌卫星细胞 17 2．2．6 EDU检测重组质粒对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响 18 2．2．7免疫荧光检测牛骨骼肌卫星细胞分化阶段的MyoG基因的表达量 19 2．2．8 Dual．Luciferase双报告基因检测启动子活性及特异性 一19 2．2．9统计分析 20 2．2．10 Q．PCR检测三种重组质粒转染细胞后相关基因的表达变化 20 2．2．11 Western Blot检测转染后相关基因蛋白的表达变化 ．2l 3结果与分析 24 3．1牛骨骼肌卫星细胞的诱导分化结果 24 3．2 miR．103在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中的表达 ．．24 3．3 rniR—103过表达载体的构建及鉴定 ．25 3．4 miR．103对骨骼肌卫星细胞增殖的影响 ．26 I 万方数据 东北农业大学理学硕士论文3．5 东北农业大学理学硕士论文 3．5 miR．103对骨骼肌卫星细胞分化的影响 ．27 3．6生物信息学分析 29 3．7 miR一103对CCNEl基因的表达调控 ．．29 3．7．1双荧光素酶载体的构建及鉴定 29 3．7．2双荧光素酶实验检测miR．103对CCNEl的启动子活性的影响 31 3．7．3实时定量PCR和Western blot检测miR．103对CCNEl的影响 32 4讨论 ． 33 5结论 35 致{射 ．36 参考文献 37 攻读硕士学位期间发表的学术论文 ．42 万方数据 CoNTENTSCONTENTS CoNTENTS CONTENTS Abstract in Chinese．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．． ．．． ．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．． ．．-．．．．．．．···-·-·-I Abstract in English．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ．．．． ．·······．-．-．-·····lII l IⅡtroduction ． ．．． ．