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miR135b在子宫内膜癌发生发展中的作用和机制初步探讨
硕士学位论文
miR-135b在子宫内膜癌发生发展中的作用 和机制的初步探讨
硕士研究生:乐珍 指导教师:刘国炳
摘要
研究背景
子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)在女性生殖系统肿瘤中占 20%~30%,在发达国家的女性恶性肿瘤中位居第四位。在发展中国家,子宫内 膜癌的发病率也位居于女性肿瘤的第7位。子宫内膜癌常发于绝经后妇女,但 近年临床研究显示,子宫内膜癌有明显的年轻化趋势。虽然早期子宫内膜癌经 过规范治疗后,5年的生存率逐年升高,但晚期、低分化子宫内膜癌或者特殊类 型的子宫内膜癌预后极差,是导致子宫内膜癌患者死亡的重要因素。因此,子 宫内膜癌的发病机理和有效治疗靶点成为改善子宫内膜癌预后的首要课题。
目前大多数研究表明子宫内膜癌与长期暴露于无抵抗的雌激素相关,或者 与肥胖、高血压、糖尿病相关,但子宫内膜癌发生的机制尚不明确,基因调控 异常如基因表达多态性等不足以完全解释子宫内膜癌的发生和发展。近年来的 研究表明mircroRNA与子宫内膜癌的发生发展有密切的关系,参与调控子宫内 膜癌的进程的分子机制和雌孕激素的表达。
miRNA是近些年来研究的热点,是一类广泛存在的非编码单链小分子RNA, 是Lee等最早在秀丽线虫中发现的,长度约为19.25个核苷酸。Lee研究团队最 早提出了miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。现在人类中miRNA已发现超过 1000多个,调控着约30%的人类基因。随后研究在很多恶性肿瘤例如直肠癌、 前列腺癌、骨肉瘤中发现miRNA发挥着促癌或抑癌作用。microRNA通过碱基
万方数据
中文摘要 互补配对的方式与靶基因的3’UTR区域结合,降解靶基因mRNA或阻遏靶基因 mRNA的翻译,在转录后水平上负性调控靶基因的表达,从而影响肿瘤的增殖、
凋亡、侵袭和转移。同样,microRNAs在子宫内膜癌进展的过程中扮演着促癌 或抑癌的双重角色,参与到子宫内膜癌发生和进展的各个时期,通过与对应的 一个或多个靶基因的3’UTR区域结合,负性调控靶基因的表达。此外miRNA 与肿瘤细胞的化疗敏感性密切相关,很在可能成为???个判断子宫内膜癌顺铂治 疗预后的标志。
miR.135b基因位于第l号染色体长臂第3区2号带的第l号亚带(1q32.1), 其存骨肉瘤、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达上升。在非小细胞肺癌中,
miR一135b通过激活Hippo信号通路和靶向LZTSl促进肿瘤转移。Arigoni等发 现mi R.135b表达上调并通过靶向雌激素受体cc、雄激素受体和缺氧诱导因子
la(hypoxia.inducible factor la,HIF—let)促进乳腺癌和前列腺癌细胞的增殖。 miR.135b在人头颈鳞癌细胞中,促进肿瘤细胞的增殖、转移、克隆,以及通过 下调FIH的表达、HIF通路的活性,成为致瘤miRNA。Valeri等的研究显示,
miR.135b的过度表达触发了老鼠和人体APC的缺失,PTEN/P13K通路的反常, SRC的过度表达及促进肿瘤的转化和进展,miR.135b的上调在与人类结直肠癌 相关的炎症中是普遍事件,并且与肿瘤分期及欠佳的临床结果有密切关系。粪 便中的miR.135b,可作为结直肠癌及高级别腺瘤的非侵袭性的生物学标记物。 然而miR.135b在子宫内膜癌中的表达、与临床的相关性及其生物学特性,还未 有报道。
基于miR.1 35b的研究现状,本课题通过探讨miR.135b在子宫内膜癌组织及4 株细胞中表达情况,运用体外细胞实验证明miR.135b的生物学特性,并进一步 探讨了miR.135b在子宫内膜癌发生发展中的作用和分子机制,为进一步寻找新 的子宫内膜癌发病机制和治疗的靶点奠定了理论基础。
方法
1 RT-PCR检测miR.135b在子宫内膜癌组织与子宫内膜癌细胞内表达
II
万方数据
硕士学位论文
从子宫内膜癌组织和细胞中抽提总RNA,按宝生物公司逆转录及荧光定量 PCR试剂盒说明书,经逆转录形成cDNA,根据SYBR Green法进行荧光定量 PCR,以2。AACt表示基因的相对表达水平。
2 RT-PCR检测瞬时转染miRNAl35b的转染效率
采用阳离子脂质体法,按照LipofectamineTM 3000试剂说明书进行瞬时转 染。转染前1天将处于对数生长期的子宫内膜癌细胞株RL.952和Ishikawa消化、 离心、计数,约为2x105/-孑L接种至6孔板中并继续培养,当细胞融合度为30.50% 时进行实验。弃上清,加入1.7ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基;将购自 于RiboBio公司的100nM siRNA}31入到无血清培养基中配制混合液①150I.tl,吹打 混匀;将5“1 Lipofectamin
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