miR130a在肺癌中的表达及相关靶基因和肺发病机制探讨.docx

山东大学博士学位论文 3．miRNA芯片检测矩阵图 ．． ．． ．．．．． 34 4．Real-time PCR检测肺癌组织miRNA-130a表达 36 (五)讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．．．39 (六)参考文献．．． ．．．．．．．．．．．．．．． ．．．． ．42 第二部分miR-130a在肺癌发病中的机制研究 (一)引言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．47 (二)材料和方法 ． ． ． 47 1．材料．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．47 1．1实验细胞株 47 1．2实验动物 ．．47 1．3主要实验试剂．．．．．．．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．48 1．4采用仪器 ． ． ．． ．．．．．． ．48 2．方法．．． ． ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．48 ～厂丌 2．1细胞培养．???． ．．．． ．．． ． ．．．．．．．．．．．．．．．48 2．2转染方法 ．． ． ．． ． ．．49 2．3实时定量RT-PCR鉴定．．。。 。。．．。。． ．．．．．．．．．．50 2．4 CCK-8检测细胞生长曲线 ． ． ．50 2．5 EdU细胞增殖实验 ． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5l 2．6流式细胞术检测肺癌细胞周期 ．．52 2．7克隆形成实验．．．．．． ．．．．． ．．．．． 53 2．8流式细胞术检测细胞凋亡 ． ．．53 2．9 Transwell实验(细胞迁移实验) ．54 万方数据  山东大学博士学位论文 2．10细胞侵袭实验 55 2．11裸鼠皮下成瘤实验 ．．55 (三)统计学分析 ． 55 (四)结果 ． 55 1．RT-PCR法检测各组细胞株中miR-130a表达 ．．55 2．miR-130a对肺癌细胞增殖能力的影响 56 3．EdU实验结果显示 ．57 4．Transwell检测肺癌细胞侵袭转移能力 ．．57 5．miR-130a诱导肺癌细胞凋亡． 59 6．软琼脂平板克隆形成实验证实miR-130a抑制肺癌细胞的 生长增殖 ．．60 7．miR-130a对肺癌细胞周期的影响 60 8．miR-130a对肺癌细胞系裸鼠皮下成瘤能力的影响 ．．61 (五)讨论 ．61 (六)参考文献 65 第三部分miRNA-130a在肺癌细胞中发挥生物机制的靶基因探 究 (一)引言 ．68 (二)材料和方法 ．68 1．材料 ．68 1．1实验细胞株 68 1．2实验动物 ．． 68 万方数据  山东大学博士学位论文 I．3主要实验试剂 ． ． ． ． ．．．． ．．68 1．4采用仪器． ． ． ．． ．．． 69 2．方法．．．．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． ．．．．．．．．．．69 2．1靶基因预测 ． ．． 69 2．2细胞培养 ．．．．．． ．．． ．．．． ．． ．．． ．．70 2．3 western blotting检测蛋白表达 ．．． ．70 2．4实时定量RT-PCR法 ． ． ．．71 2．5 miR-130a mimics及inhibitor细胞转染．．．． ．．71 2．6 RT-PCR检测GOLPH3 mRNA表达水平 ．．72 2．7构建基因载体 ．． ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．72 2．8双荧光素酶报告系统检测microRNA、重组质粒转染293 T 细胞 ．．．．．．． ． ． ．．． ．．．．．．．．．．． ．．．．78 2．9 CA)LPH3真核表达载体构建与转染 79 2．i0 CCK-8检测转染后细胞生长曲线 ．．79 (三)统计学分析 ．79 (四)结果．．． ． ．．． ．．．．。 ．．．．80 I．预测由miR-130a直接调控的靶基因结果 ．80 2．肺癌组织／癌旁组织以及肺癌细胞系／正常支气管上皮细胞 系中的60LPH3蛋白表达 ．81 3．miR-130a对GOLPH3蛋白及mRNA表达水平的影响 ．82 4．质粒构建的鉴定 ． ．．．． ．．．． ．．．．83 5．双荧光素酶报告系统活性检测．．．． ．．．． ．．．．．84 厂可 万方数据  山东大学博士学位论文 6 GOLPH3介导miR-130a对肺癌细胞增殖的抑制作用 85 7．Western Blot检测Wnt／B-catenin信号通路相关蛋白的 表达 ．．86