miR139对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的节作用.docx

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)．no N0．：120910802 Dissertation for the Master Degree The Regulation of miR--139 on Lactating Function of Dairy Cow Mammary Epithelial Cells Candidate：Sun Xia Supervisor：Associate Professor Cui Yingj un Degree Category：Master of Science College：College of life science First level discipline：B iology Second level discipline：Biochemistry and Molecular Biology Harbin China June 2015 万方数据 —————』蝥一㈣Y27㈥7 —————』蝥一㈣Y27㈥7暑暑詈詈詈詈詈詈詈詈曼曼量曼!曼皇!!鼍曼曼!皇皇鼍曼寡!!!!曼皇量曼曼詈曼!蔓曼皇皇詈詈皇皇皇暑鼍鼍——置皇詈曹詈皇曼!曼曼!1 5㈣7 一 目 录 摘要 I 英文摘要 III 1前言 1 1．1 miRNAs的研究进展 一1 1．1．1 miRNAs的发现 1 1．1．2 miRNAs的特点 1 1．1．3 miRNAs的作用机理 ．1 1．1．4 miRNAs的检测方法 2 1．1．5 miRNAs的靶标预测 3 1．1．6 miRNAs的靶标鉴定 4 1．1．7 miRNAs的功能 一5 1．2 miR-139研究进展 一5 1．3 GH与GHR研究进展 ．6 1．3．1 GH与GHR的结构 ．．6 1．3．2 GHR介导的信号传导途径 ．．6 1．3-3 GH的生理功能 7 1．3．4 GH及其受体在乳腺中的作用 ．7 1．4 IGF—I与IGF—IR研究进展 ．．8 1．4．1 IGF-I与IGF．IR的结构 ．8 1．4．2 IGF．IR介导的信号传导途径 9 1．4．3 IGF-IR的生理功能 9 1．4．4 IGF—IR在乳腺中的作用 10 1．5研究的目的和意义 10 2材料与方法 ．12 2．1实验材料 一12 2．2主要仪器和设备 12 2．3实验试剂 一13 2．4试剂的配制 一14 2．5实验方法与步骤 一15 2．5．1 miR-139的靶基因预测 一15 2．5．2 miR一139及其靶基因在不同发育阶段及不同乳品质奶牛乳腺组织中的表达 ．．15 2．5．3奶牛乳腺上皮细胞的培养和鉴定 ．19 2．5．4 miR-139 mimic对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响 20 2．5．5 miR-139 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响 ．22 万方数据 东北农业大学理学硕士学位论文2．5．6 东北农业大学理学硕士学位论文 2．5．6 miR一139 inhibitor在GHR沉寂后对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响 23 2．5．7数据处理 23 3结果与分析 ．24 3．1 miR一139、GHR和IGF．IR在不同发育阶段及不同乳品质奶牛乳腺组织中的表达 24 3．1．1不同发育阶段及不同乳品质奶牛乳腺组织中总RNA质量检测 一24 3．1．2 miR一139、GHR和IGF．IR在不同发育阶段及不同乳品质奶牛乳腺组织中的mRNA 表j太 一24 3．1．3 GHR在不同发育阶段及不同乳品质奶牛乳腺组织中的蛋白表达 26 3．2奶牛乳腺上皮细胞的培养和鉴定 27 3。2．1奶牛乳腺上皮细胞的原代培养 一27 3．2．2奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18鉴定 28 3．3 miR-139的靶基因预测 28 3．4 miR．139基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞的影响 一29 3-4．1 miR一139 mimic对奶牛乳腺上皮细胞中miR-139、GHR以及IGF．IR mRNA表达的 影响 ．： 29 3．4．2 miR一139mimic对奶牛乳腺上皮细胞中IGF—IR及泌乳相关信号通路蛋白表达的影响 ．．：；l 3．4．3 miR-139 mimic对奶牛乳腺上皮细胞增殖能力及活性的影响 ．33 3．4．4 miR-139 mimic对奶牛乳腺上皮细胞中B．酪蛋白、甘油三酯和乳糖含量的影响 34 3．5 miR-139基因沉寂对奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响 37 3．5．1 miR一139 inhibitor对奶牛乳腺上皮细胞中miR-139、GHR以及IGF．