MiR124通过靶基因Bi调节MPTP帕金森病模型中细胞凋亡和自噬.docx

博士学位论文MiR．1 博士学位论文 MiR．1 24通过靶基因Bim调节MPTP帕金 森病模型中细胞凋亡和自噬 博士研究生：王惠清 指导教师：张世忠教授、主任医师 摘要 研究背景 帕金森病是患病率最高的运动障碍性疾病，以静止性震颤、运动迟缓和肌 强直为主要临床症状，通常也合并嗅觉障碍、便秘、睡眠障碍和抑郁等非运动 症状。从有无遗传背景可以分为家族性和散发型，家族性帕金森病与基因突变 密切相关，常见的基因包括LRRK2、SNCA、VPS35、EIF4G1、PARK2、PINKl、DJ_l 等。散发型帕金森病的发病机制尚不清楚，年龄是帕金森病最主要的危险因素， 患病率随年龄的增长而显著增加，另外某些职业暴露也是引起帕金森病的主要 原因，例如杀虫剂、除草剂和重金属等。目前帕金森病的主要治疗原则是综合 药物治疗，在帕金森病后期药物控制不佳时可考虑手术治疗并辅以康复心理治 疗等，药物治疗是目前最主要的治疗措施，但其仍然只是替代治疗不能根治帕 金森病。帕金森病的主要病理改变是中脑黑质区致密部多巴胺能神经元的缺失 和路易小体的沉积，具体机制被认为与氧化应激，线粒体功能障碍和蛋白质清 除功能障碍等相关。线粒体功能障碍可以表现为线粒体外膜渗透导致神经元凋 亡，同样蛋白质清除功能障碍是因为细胞自噬功能紊乱，同样会引起神经元自 噬性死亡。因此，调节帕金森病中神经元凋亡和神经元自噬的途径将会是一个 非常有效的神经保护措施。 microRNA是一类高度保守的大约只有21-～25个核苷酸的非编码单链RNA， 通过在转录水平抑制靶基因的表达，参与调节体内几乎所有的生理病理过程， 万方数据 摘要例如生长发育、增生、炎症、肿瘤和神经退行性病变等。microRNA的表达具有 摘要 例如生长发育、增生、炎症、肿瘤和神经退行性病变等。microRNA的表达具有 时间和空间特异性，在不同发育阶段、不同组织或者在病理条件下，某一个特 定的mi croRNA其表达水平均存在差异。研究表明，mi croRNA与帕金森病密切 相关，某些microRNA在帕金森病中表达异常，miR-7、miR-153、miR-34b和 miR一34c在帕金森病中表达均显著下降，另外，某些microRNA能直接调控帕金 森病相关基因的表达， 例如miR-7和miR-153以alpha-突触核蛋白为靶基因。 因此， microRNA可能是早期诊断帕金森病的一种敏感生物标志物，并且调控 microRNA的表达有望延缓帕金森病的疾病进展。 MiR一124是一个高度表达于神经系统内的microRNA，其表达含量比其他组 织的100倍还要丰富，在例如脑脊髓炎和胶质瘤疾病等神经系统疾病中表达下 降，同时对于缺血性脑损伤和卒中等疾病具有显著的神经保护作用。但是， miRNA一124在帕金森病中的表达变化以及其是否对帕金森病也具有神经保护作 用均尚不清楚。 因此，本课题拟在MPTP帕金森病模型中研究miR-124的表达变化，并探讨 其是否参与调节帕金森病中多巴胺能神经元凋亡和细胞自噬过程，是否具有神 经保护作用及具体机制。 研究内容 。第一章miR-124在MPTP诱导的帕金森病模型中的表达及意义 目的：检测MPTP诱导的帕金森病小鼠和MPP+处理的SH-SY5Y细胞中miR-124 的表达 方法： (1)MPTP连续腹腔注射5天构建帕金森病小鼠模型，按最后一次注射 MPTP后的不同时间点(O天，l天，2天，4天，7天和21天)分组，收集各组 小鼠中脑组织，提取总RNA，逆转录为cDNA，RT-PCR扩增miR一124和U6。以 U6为内参，采用2^-AAct法比较各组miR一124的相对表达量，另外收集正常组小 II 万方数据 博士学位论文鼠和21天MPTP小鼠中脑组织，以miR一1．24原位杂交联合TH组织免疫荧光染色 博士学位论文 鼠和21天MPTP小鼠中脑组织，以miR一1．24原位杂交联合TH组织免疫荧光染色 评估中脑多巴胺神经元内miR一124的表达。(2)以不同浓度(O．25ram，0．5mM， ImM和2．5mM)MPP+处理SH—SY5Y细胞24小时后，或以imM MPP+处理SH-SY5Y 不同时间(0，6，12，24，48小时)后，收集细胞，提取总RNA，同样以qRT-PCR 定量miR-124的表达。 结果：相比于正常组小鼠，MPTP给药后所有时间点的小鼠中脑组织内的miR一124 表达水平均显著性下降，miR一124原位杂交结果显示在MPTP帕金森病小鼠中脑 保留的多巴胺能神经元内的miR一124信号更弱。相比于正常组，SH—SY5Y细胞 被不同浓度的MPP+处理24小时后，miR一124的表达水平均显著性下降，而只有 当MPP+处理SH—SY5Y细胞12小时以后， miR一12