miR3188参与FOXO1调mTORpPI3KAKTcJUN正反馈通路抑制鼻咽癌细胞的增殖.docx

博士学位论文miR-3188参与FoX01调节 博士学位论文 miR-3188参与FoX01调节 mTOR-pPl3K／AKT-c．JUN正反馈通路抑 制鼻咽癌细胞的增殖 博士研究生：赵孟阳 指导老师：方唯意教授 摘兽 研究背景与目的 MicroRNAs(miRNAs或IIli如)在人类各种疾病的发展，细胞分化，增殖， 周期调控，细胞死亡中发挥重要的作用，也包括肿瘤的发生与发展。MiR．3188 作为近年来新发现的miRNA，在肿瘤中的功能和机制目前还未有任何报导。 鼻咽癌是发生于鼻咽粘膜的一种上皮来源的恶性肿瘤，通常集中发生在东 南亚地区，鼻咽癌的发生可能与EB病毒感染、特定饮食习惯、基因易感性等 因素有关。尽管在美国非常少见，却占儿童鼻咽肿瘤的三分之一。在现在的研 究中，miRNAs的异常表达广泛涉及到了鼻咽癌的病理进程。比如，EBV病毒 编码的microRNABARTl通过调控PTEN介导的信号通路促进了鼻咽癌细胞的 转移。此外，在前期的研究中，我们发现抑癌基因PDCD4通过调控miR．184 进而抑制c．MYC和BCL2的表达来调节鼻咽癌细胞的增殖和凋亡。 FOX01转录因子属于翼状螺旋／叉头转录因子家族中的一员，AKT能够促 进FOX01磷酸化从而出核而失去活性。以前研究表明FOX01主要通过调节细 胞周期进展，分化，代谢以及凋亡而发挥肿瘤抑制因子的作用。进一步的， 万方数据 摘要FOXO 摘要 FOXO 1的低表达已经在多种肿瘤里面展示，比如霍奇金淋巴瘤，乳腺癌，横纹 肌肉瘤等等。虽然该基因在肿瘤研究已经有较多的报道，然而在鼻咽癌中，该 基因功能和具体的分子机制几乎没有报道，目前仅有研究表明FOX01参与了 LMPl介导的鼻咽癌细胞周期进展以及化疗抵抗；高表达的磷酸化的AKT与磷 酸化的FOX01有相关性。 在本次研究中，我们分析了miR．3188，mTOR和FOX01在鼻咽癌中的关 系并且发现miR-3188．mTOR-pPl3K／AKT-c．JUN变异环路，这个变异环路抑制 了鼻咽癌细胞的增殖，为鼻咽癌发生发展的分子机制研究提供新思路。 研究内容与方法 1．miR．3 1 88对鼻咽癌细胞生物学功能的影响及其分子机制 (1)利用MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期、Edu与裸鼠皮下成瘤实 验观察miR．3188对细胞生长、增殖能力的影响，确定miR-3188在鼻咽癌细胞 中的功能： (2)为了明确miR-3188抑制鼻咽癌细胞增殖的机制，Western blot检测 miR一3188对P—AKT，p-P13K，c—JUN，CCNDl，P21，P27蛋白表达的影响。 2．miR一3188靶基因验证 (1)利用生物信息学软件预测mTOR为miR．3188的一个直接靶标： (2)荧光定量PCR检测过表达或干扰miR一3188的细胞中mRNA水平mTOR 表达的变化： (3)Western blot实验检测过表达或干扰miR．3188的细胞中蛋白水平mTOR 和p-roTOR表达的变化； (4)免疫组化实验检测过表达miR-3188的裸鼠皮下成瘤组织中mTOR的表 达： (5)利用双荧光素酶报告实验确定miR．3188直接靶向mTOR； (6)MTT实验，Edu实验和细胞周期实验检测mTOR对过表达miR．3188的 鼻咽癌细胞增殖功能的影响； II 万方数据 博士学位论文(7)Western 博士学位论文 (7)Western blot检测干扰mTOR后下游基因mTOR，P．mToR，P13K， P—P13K，AKT，P-AKT，CCNDl和c．JUN的变化。 3．C-JUN通过结合在miR．3188的启动子区抑制其表达 (1)为了预测miR．3188的转录调节作用，利用生物信息学软件分析了 miR一3 l 88转录起始位点上游3000kb的长度，发现有3个c．JUN的结合位点； (2)荧光定量PCR检测干扰c．JUN的鼻咽癌中，miR．3188表达的改变； (3)EMSA实验证明miR一3188启动子上c-JUN的三个结合位点是否有效； (4)CHIP实验进一步证明c—JUN与miR-3188的启动子结合： (5)双荧光素酶报告实验验证c删能够调节miR-3188启动子区的活性进 而抑制其转录。 4．FOX01在鼻咽癌中的功能和机制研究 (1)利用MTT实验、平板克隆形成实验、细胞周期、Edu与裸鼠皮下成瘤实 验观察FOX01对细胞生长、增殖能力的影响，确定miR-3188在鼻咽癌细胞中 的功能； (2)为了明确miR-3188抑制鼻咽癌细胞增殖的机制，Western blot检测 FOX01对P—AKT，p-P13K，c—JUN，CCNDl，P21，P27蛋白表达的影响； (3)用免