MiR328通过组蛋白H2AX调节肺癌细胞凋亡机制研究.docx

独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行 的研究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：丝年—蔓月4日 万方数据 关于学位论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“√”)： 1．必威体育官网网址口，在～年解密后适用本授权书。 2．不必威体育官网网址口。 作者签名：i；勘影薹 日期：为脾洲日 翩戤2弘橡 日期：≯∥年上月习日 万方数据 目 目 录 一、摘要 ．1 (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 ．3 二、正文 5 (一)前言 ．5 (二)材料和方法 7 1．材料 ．7 1．1细胞系 7 1．2载体 ．7 1．3菌种 8 1．4引物的设计合成 ．．8 1．5主要仪器 ．．8 1．6主要试剂及溶液的配制 ．．10 2．方法 ．14 2．1 MiRNA芯片数据分析 14 2．2 细胞的培养与复苏 14 2．3 H2AX表达载体的构建和鉴定 ．1 5 2．4 质粒和siRNA的转染 ．．20 2．5 双荧光酶报告基因分析 ．．20 2．6 总RNA的提取及荧光定量PCR ．．21 2．7 流式细胞仪检测细胞凋亡及分析细胞周期 24 2．8 蛋白质的提取及Western Blot ．26 2．9统计分析 29 (三)结果 ．30 万方数据 1．肺癌细胞中MiRNA．328的表达高于正常对照组 1．肺癌细胞中MiRNA．328的表达高于正常对照组 30 2．肺癌细胞凋亡过程中MiRNA．328低表达 ．．3 1 3．MiRNA．328调节肺癌细胞凋亡 ．．32 4．组蛋白H2AX是MiRNA．328的靶基因 ．34 5．MiRNA．328通过靶基因H2AX抑制细胞凋亡 36 (四)讨论 38 (五)结论 38 (六)参考文献 39 三、综述 ．．43 (一)综述 ．．42 (二)参考文献 48 四、中英文缩写 52 五、攻读学位期间发表文章情况 ．54 六、致谢 55 万方数据 大连医科大学硕士学位论文MiR一328通过组蛋白H2AX调节肺癌细胞凋亡的研究 大连医科大学硕士学位论文 MiR一328通过组蛋白H2AX调节肺癌细胞凋亡的研究 硕士姓名：张玲 指导教师：陆承荣教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 目的：非编码小分子RNA(miRNAs)长度约22个核苷酸，通过结合靶基因mRNA 3’非翻 译区(3’UTR)的互补序列，导致mRNA降解或抑制蛋白翻译，从而调节相关靶基因表 达，在机体内各种生理及病理过程中发挥重要作用。有研究表明，miRNAs参与细胞增 殖、分化和凋亡等生理过程。H2AX是组蛋I兰tH2A家族一员，它不仅调节DNA损伤修复， 还具有一项新的重要生理功能：凋亡调控作用。现已发现H2AX在肿瘤细胞凋亡中发挥 关键调控作用，因而被认为是一种新的抑癌蛋白。本课题旨在探讨miRNA．328在肺癌中 的功能与作用以及与组蛋I兰tH2AX之间的关系，阐明miRNA．328通过H2AX表观遗传调 控肺癌细胞凋亡的分子机制。 方法：我们利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因表达数据库(GEO)中的四个数 据库，GSEl5008、GSE24709、GSE31568和GSE61741数据库，统计其中肺癌患者 及正常对照组之间的miRNA．328的表达情况，揭示miRNA．328的表达与肺癌的相关性。 使用三个不同浓度(100州，10州，l州)的依托泊苷(VPl6)诱导肺癌细胞凋亡，并检测 miRNA．328表达水平，实验证明miRNA．328与肺癌细胞凋亡的关系。然后，转染 miRNA．328和miRNA．328抑制分子，观察对肺癌细胞(A549和H1650)凋亡和周期的影 响。使用TargetScan，miRanda和miRbase软件预测miRNA．328下游潜在的靶基因H2AX， 并通过qRT-PCR、western blot以及荧光素酶报告基因实验进行验证。最后，我们在A549 和H1650细胞中共转