mir374b和miR299对成肌细胞分化的作用及其子机制.docx

国家转基因动物新品种培育重大专项(2008-2013ZX08006—002) 国家转基因动物新品种培育重大专项 (2008-2013ZX08006—002) Supported by the Grants from the National Project for Breeding of Transgenic Pig(2008-·2013ZX08006--002) 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 3一 如需必威体育官网网址，解密时间 年 月 吕 是否必威体育官网网址 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名： 雪若④ 时问： 卅fr年 I了月≯y日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存．汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：必威体育官网网址学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交必威体育官网网址的论 文)在解密后适用于本授权书． 学位论文作粼：至缶@ 导师样：书莎i看 签名日期：弦6-g，≯月确 签名E期：≯心年I≯月砂日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 万方数据 miR一374b和miR一299对成肌细胞分化的作用及其分子机制目 miR一374b和miR一299对成肌细胞分化的作用及其分子机制 目 录 摘要 i ABSTRACT ．．iii 缩略词表(Abbreviations) i 第一章文献综述 ．1 1．1引言 l 1．2骨骼肌的发育 1 1．2．1骨骼肌的来源 1 1．2．2骨骼肌的形成 2 1．2．3骨骼肌形成过程中相关调控因子 3 1．2．4调节骨骼肌形成的信号通路 5 1．3 microRNA概述 7 1．3．1 microRNA的生物合成及作用机制 8 1．3．2 microKNA的检测方法 8 1．3．3 microRNA靶基因的预测及鉴定 ．10 1．4 microRNA调控骨骼肌的发育 13 1．4．1骨骼肌中高表达的microRNA 13 1．4．2 microRNA与成肌细胞的增殖和分化 ．15 1．4．3 miRNA调节肌纤维类型的转变 ．．16 1．4．4 microRNA与生肌调节因子和生肌增强因子 ．16 1．5本研究的目的意义 ．17 第二章材料和方法 18 2．1材料 18 2．1．1实验材料 ．．1 8 2．1．2主要仪器设备 ．．18 2．1．3主要试剂及试剂盒 ．．19 2．1．4常用试剂及其配置 20 2．2方法 ．21 万方数据 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文2．2．1细胞培养 华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文 2．2．1细胞培养 21 2．2．2总RNA提取 23 2．2．3 miRNA的定量分析 ．．23 2．2．4基因的定量分析 25 2．2．5双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建 26 2．2．6 Western bloRing分析 ．32 2．2．7免疫荧光 34 2．2．8细胞增殖实验 34 2．2．9生物信息学分析数据库及软件 35 2．2．10统计分析 ．35 第三章结果与分析 36 3．1调控Myf6基因的microRNA鉴定 36 3．1．1靶定Myf6 3’UTR的microRNA预测 ．36 3．1．2构建Myf6基因3’UTR双荧光素酶报告载体 36 3．1．3双荧光素酶报告实验 37 3．1．4 miR-374b调控内源Myf6表达 39 3．2 miR-374b调节骨骼肌发育 ．40 3．2．1 miR．374b的序列保守性分析 40 3．2．2 miR．374b组织表达谱分析 40 3．2．3细胞表达分析 41 3．2．4 miR一374b抑制成肌细胞分化 43 3．2．5 miR-374b对肌纤维类型的影响 47 3．2．6 miR．374b对C2C12细胞增殖的影响 ．49 3．3 miR一299调节骨骼肌发育