mir425对3T31细胞分化的作用研究.docx

miR-425对3T3．LI细胞分化的作用研究目 miR-425对3T3．LI细胞分化的作用研究 目 录 摘要 ．．i ABSTRACT ．．iii 中英文缩写对照表 ．v 第一章文献综述 ‘ ．．1 1引言 一1 2脂肪概述 ．．1 2．1脂肪组织的分类 l 2．1．1白色脂肪组织 ．1 2．1．2棕色脂肪组织 ．2 2．2脂肪组织的生成 2 2．3脂肪细胞分化的转录调控 3 2．3．1 PPAR), 3 2．：；．2C／EBPa． ． ． ．． ． ． ． ． ．． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．．． ．．4 3microRNA及其对脂肪细胞分化的调控 ．5 3．1 microRNA的生物合成和作用机制 ．5 3．2miRNA对脂肪细胞分化的调控 6 3．2．1miRNA促进脂肪细胞分化 ．7 3．2．2miRNA抑制脂肪细胞分化 ．8 4．miR-425可能是调控脂肪细胞分化的重要候选miRNA ．9 4．1 Zfp423基因与脂肪生成的相关研究 9 4．2miR-425的研究 ll 5研究目的和意义 1 1 第二章材料与方法 12 2．1载体和菌株 ．12 2．2主要试剂和仪器 。12 2．3主要溶液的配制 ．13 2．4细胞培养及诱导分化 ．14 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文2．4．1细胞的复苏 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．4．1细胞的复苏 14 2．4．2细胞的常规培养 14 2．4．3细胞冻存 14 2．4．4 3T3．L1细胞的诱导分化 ．15 2．5细胞转染及双荧光素酶活性的测定 ．15 2．5．1细胞的转染 15 2．5．2双荧光素酶相对活性的检测 15 2．5．2．1细胞裂解 15 2．6细胞总RNA的提取 ．16 2．7 Q．PCR分析 17 2．7．1 miRNA的定量分析 ．17 2．7．2基因的定量分析 18 2．8油红0染色 20 2．9甘油三酯和游离脂肪酸含量的测定 ．．20 2．10靶基因预测以及预测靶基因3UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构 ；枣 ：!l 2．10．1靶基因预测 ．2l 2．10．2预测靶基因3UTR双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建 ．．21 2．1 1靶基因的鉴定 27 2．12 Westem blouing分析 ．27 2．12．1蛋白提取 ．27 2．12．2 SDS．PAGE电泳 27 2．1 2．3转膜 ．28 2．12．4抗原抗体免疫反应 ．28 2．12．5抗体 ．．29 2．13主要数据库及分析软件 29 2．14统计学分析 29 第三章结果与分析 30 3．1 miR一425—5p序列保守性分析 ．30 11 万方数据 miR-425对3T3．L1细胞分化的作用研究3．2 miR-425对3T3．L1细胞分化的作用研究 3．2 miR-425—5p的组织表达谱分析 ．30 3．3 miR-425-5p的细胞表达谱分析 ．3 l 3．4 miR-425-5p抑制小鼠3T3．L1前脂肪细胞的分化 32 3。5 miR．425—5p靶基因的鉴定 ．35 3．6 miR-425—5p通过靶定Zfp423抑制脂肪细胞分化 37 第四章讨论 39 4．1miR-425．5p的靶基因预测 ．．39 4．2miR-425-5p通过调控Zfp423的表达来抑制脂肪细胞分化 40 4．3 miR-425．5p抑制脂肪细胞分化的意义 ．4l 第五章结论 42 5．1本研究的主要成果 ．．42 5．2本实验不足之处及下一步计划 ．．42 参考文献 43 附翥乏 ．．5 l 致谢 ．．52 III 万方数据 miR．425对3T3．LI细胞分化的作用研究摘要 miR．425对3T3．LI细胞分化的作用研究 摘要 近年来，大量的研究表明，miRNA在脂肪细胞分化过程中发挥着重要的作用， miRNA通过靶定与脂肪细胞分化相关的基因来调控脂肪细胞分化。对miRNA进行 序列保守性分析、靶基因预测和功能分析，从而选择miR-425．5p为研究对象。本试 验采用双荧光素酶报告基因检测、实时定量PCR(Q．PCR)、免疫印迹(Western blot) 等方法对miR-425—5p的作用和功能进行研究。主要的研究结果如下： (1)经miRBase网站对多种物种的miR-425序列对比发现，包括猪在内的多种 哺乳动物的miR-425．5p的成熟序列保守性很高，只有少许碱基不同，种子序列是完 全相同的，保守性也很高。 (2)通过实时定量PCR技术检测miR-425—5p在5月龄大白猪心、肝、脾等多 个组织中的表达量，结果显示：miR．425．5p在大白