miR433在膀胱癌中的抑癌作用及其分子机研究.docx

浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 致谢 致谢 五年的硕博生涯即将结束，在这个即将和母校浙江大学说再见的时候，心中 唯有不舍与感恩之情，衷心感谢每一位在我成长道路上关心我、帮助我和提携我 的亲友恩师们，无以为报，但没齿难忘。 首先要感谢的是我的恩师，浙江大学医学院附属第一医院泌尿外科谢立平教 授。在我本科即将毕业，憧憬未来规划和发展之时，恩师犹如浩海中的灯塔为我 指明了方向。恩师国际化的视野，严谨勤奋的治学态度，缜慎的思路，前沿而精 髓的学术探索精神，从容、睿智、潇洒豁达的不凡学者气质不仅使我明白了如何 看待事物，懂得了如何规划自己的人生，而且还明白了为人者为医者的态度和道 理，深刻影响着我现在以及今后的工作和生活。 感谢郑祥毅、秦杰、毛祺琦、杨凯、林奕伟、陈弘、茅叶青、胡政麾、 王潇、吴俭、梁臻、刘云夫、徐向来、朱意、李诗琪、孟帅、李江枫等师兄弟妹 们在本研究实施和论文撰写过程中给予的帮助!你们的无私和谦逊让我获益良多! 感谢浙一医院泌尿外科的全体医护人员；感谢卫生部多器官联合移植重点实 验室全体老师和工作人员给我提供优越的实验平台和技术支持! 感谢我的班级体同学，我的同寝室兄弟，能成为温馨集体的一份子是我的幸 运，优秀如你们让我获益良多! 感谢我的爱人及家人。有了你们的全力支持和鼓励方能让我安心求学。祝愿 你们永远健康平安! 最后， 再次向所有曾给予我关心、帮助和支持的人表示衷心的感谢! 万方数据 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 中文摘要 miR．433在膀胱癌中的抑癌作用及其分子机制研究 浙江大学医学院 外科学(泌尿外科) 博士研究生 徐鑫 导弋r 师j，oI． 谢立平 中文摘要 背景： 膀胱癌是泌尿道最常见的恶性肿瘤，直接威胁着众多患者的生存健康和质量。 在全世界范围内，它是男性中第七常见的肿瘤，而在女性中则排在第十七位。膀 胱癌是一种进展性的移行上皮来源肿瘤。有大约三分之一的膀胱癌会发生局部浸 润或远处转移。虽然膀胱癌的诊治一直在不断发展和进步，但是根治性膀胱切除 术仍然是浸润性膀胱癌的治疗金标准，文献报道5年生存率只有62％。如何抑制 膀胱癌的进展已经成为目前治疗研究上的关键问题，而寻找新的分子靶点、探究 膀胱癌进展的分子机制则是研究热点。 MicroRNA(miRNA)是一类长度约为19—22nt，具有在转录后水平调控基因 表达功能的内源性非编码小RNA。它们可以直接靶向目的基因信使 RNA(messengerRNA，mRNA)的3’非翻译区(3-UTR)上的特定序列来抑制或是 降解靶基因mRNA，从而下调靶基因的表达。越来越多的证据表明miRNA表达异 常与膀胱癌的进展和转移有关。 目的： 在收集的膀胱癌组织标本以及膀胱癌细胞株中利用荧光定量PCR法检测 miR．433的表达情况，探索miR-433表达下调的表观遗传学机制。采用获得性功能 实验观察miR．433在膀胱癌细胞系T24和UM．UC．3中的生物学功能。利用生物信 息学预测和荧光素酶双报告系统寻找miR-433的直接作用靶点，并通过分析靶点 万方数据 浙江大学博士学位论文 浙江大学博士学位论文 中文摘要 基因的生物学功能，验证miR-433对于靶点的调控价值，以及下游介导的分子信号 通路。 方法： 1)在13对配对的膀胱癌组织标本中检测miR-433的相对表达量，统计分析 miR-433在膀胱癌和癌旁组织中的表达差异，并分析miR-433表达下调是否和启动 子区高甲基化有关； 2)通过转染miR．433模拟体(mimic)上调miR．433表达量来进行获得性功 能实验。通过CCK．8、平板克隆形成、划痕实验和Transwell实验等方法来探索上 调miR-433的表达对于细胞增殖和迁移侵袭能力的影响； 3)在线生物信息学预测网站对miR．433的直接靶向基因进行预测，然后利用 荧光定量PCR和Western Blot等证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化，并利 用荧光素酶双报告实验对miR．433的靶向序列进行鉴定，并进一步使用RNA干扰 等实验来明确靶向调控关系和下游机制。 结果： 1)miR．433在，哮胱癌中表达下调。我们使用荧光定量PCR在13对临床膀胱 癌组织标本和癌旁组织，以及三株膀胱癌细胞系T24，UM．UC．3和5637中检测了 miR．433的表达水平。结果发现miR-433在肿瘤组织中的表达量相比癌旁组织显著 降低。miR-433在三株膀胱癌细胞株中的表达量相比SV-HUC—l也显著降低。 2)BSP结果显示在膀胱癌细胞株(T24，UM．UC．3和5637)中，miR-433启 动子区处于高甲基化水平状态。5．氮杂．2’．脱氧胞苷治疗(5．氮杂胞苷)处理后 miR一433的表达水平显著上升。 3)获得性