HCV不同长度N5B的表达纯化及体外活性测定新方法的建立-流行病与卫生统计学专业毕业论文.docx

JIC：寄r医科大掌硕士掌位论文HCV不同长度NS5B的表达纯化及体外活性 JIC：寄r医科大掌硕士掌位论文 HCV不同长度NS5B的表达纯化及体外活性 测定新方法的建立 摘 要 全球有3％的人感染丙型肝炎病毒(HCV)，可导致肝硬化和肝 癌等慢性肝病。目前，无HCV疫苗，主要用仅．干扰素和利巴韦林治 疗，但有较大的副反应，并且应答率仅约50％。因此，需要研制出更 有效更广谱的抑制剂。HCV NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)，是HCV复制的关键酶，在正常的宿主细胞中不存在这个 酶的相似结构同系物。因此这是一个抗病毒研究的很好的靶标，已用 于体外筛选HCV抑制剂。体外筛选I-ICY NS5B蛋白酶抑制剂的关键是 获得溶解性好、活性高的NS5B蛋白，NS5B蛋白C端对其酶活性及水 溶性有影响。本研究制备NS5B蛋白C端删除不同长度的三种重组蛋 白，以筛选溶解性好、活性高的NS5B蛋白，建立体外检测NS5B蛋白 RNA依赖的RNA聚合酶活性的新方法，为高通量筛选HCV抑制剂 奠定基础。 构建了高效表达全长NS5B(NS5B．FL)、C端截短21个氨基酸 NS5B(NS5B-C21)及C端截短51个氨基酸NS5B(NS5B．C51) 蛋白的三种工程茵。利用PCR技术扩增三种长度的NS5B基因，BamH lCmXho，双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pZT-28a(+) 上，转化大肠杆菌BL21(DE3)茵株，PTG诱导表达，SDS电 泳进行鉴定。成功构建了三种重组质粒pET-28a(+)·-NS5B-FL， pET-28《+)-NS5B—C2 1，pET-28a(+)-NS5B—C5 1， 分别表达 6His．NS5B．FL，6His．NS5B．C21，6His．NS5B．C5 l三种融合蛋白，表达 的6His．NS5B．FL主要以包涵体形式存在，而表达的6His-NS5B．C21、 6His-NS5B．C5 1的可溶性明显增加。 建立了表达的三种HCV NS5B蛋白的纯化方法，纯化获得了三 种蛋白．为易于纯化，在表达三种蛋白的C端均增加了6xHis标签， 用Ni柱亲和层析纯化，获得的三种蛋白经SDS．PAGE检测，均显示 单一的蛋白条带。纯化的NS5B．C21蛋白浓度相对较高，选用此蛋白 南京医科大掌硕士掌位论文 南京医科大掌硕士掌位论文 用于NS5B RNA聚合酶活性分析。对获得的三种蛋白的抗原性进行 了分析，间接ELISA法检测已知的HCV抗体阳性及阴性血清，显示 三种蛋白均有较好的抗原性和特异性，提示该蛋白不仅可用于酶活性 分析，也可能用于抗体检测及研制检测试剂。 将纳米磁分离、酶联等技术相结合，利用表达的NS5B蛋白，建 立了一种体外检测NS5B RNA聚合酶活性的新方法。将RNA模板修 饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应管内， 再加入引物，纯化的NS5B蛋白酶，NTP，Bio．11．UTP等反应体系。 通过掺入生物素标记单体，利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合 酶的活性，使另一条RNA链得到延伸，在外磁场下分离除去非特异 性吸附片段，再与酶标记的亲和素结合，洗涤后，向微孔内加入底物 显色剂，通过是否显色来判定NS5B蛋白酶活性。该方法可直接通过 显色来检测NS5B的RNA聚合酶活性，并且可以在96孔板内进行高 通量检测，为高通量筛选NS5B蛋白酶抑制剂奠定了基础。 关键词：丙型肝炎病毒；非结构区5B蛋白；RNA依赖的RNA聚合 酶；基因克隆；蛋白表达、纯化；磁性纳米颗粒；活性测定 南京医科大学硕士掌位论文 南京医科大学硕士掌位论文 Expression，Purification of HCV NSSB and Establishment of a Novel Method for Measuring its Enzyme Activity／n vitro Abstract Hepatitis C virus(HCV)is the major etiologic agent responsible for non-A，non-B hepatitis．More than 1 70 million people，or 3％of the entire world population，are infected with HCV． Viral infection frequently leads to chronic liver diseases，including cir．rhosis and hepatocellular carcinoma． Although much research has been focused on the development o