医学实验室认可技术要求关键控制点pcr专业.ppt

5.6 检验程序的质量保证 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理 核酸的分离纯化 靶核酸提取的质量 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 核酸样本制备及扩增检测的质控 产物检测的质控 核酸样本的制备、扩增检测及其质量控制 5.6 检验程序的质量保证 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理 靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。 5.6 检验程序的质量保证 核酸的分离纯化 核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。 5.6 检验程序的质量保证 靶核酸提取的质量 纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。 核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定 血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果。 ●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL 5.6 检验程序的质量保证 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 临床标本中：血清或血浆中的血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份 、降解靶核酸的核酸酶等。 核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。 5.6 检验程序的质量保证 实验室应有室内质控方案和室间质评计 1. 室内质量控制标准操作程序； 阳性对照、阴性对照、试剂空白对照、 阳性（临界值）对照 2. 实验室应参加EQA。 失控结果的分析，纠正措施及其效果评价等。 5.6 检验程序的质量保证 无商品化质控物时，可采用自制的质控物。 质控物的评价：均一性、瓶间差、稳定性等。 理想质控物： 基质与待测样本一致； 所含待测物浓度接近试验的决定性水平； 稳定； 靶值或预期结果已定； 无已知的生物传染危险性； 单批可大量获得； 价廉。 5.7 检验后程序 检验结果的审核； 原始样品及其他实验室样品的保存应符合经批准的政策 ； 不再用于检验样品的安全处置应符合废弃物处置的法规或有关废弃物管理的规定。 5.8 结果报告(2-1) 检测结果的报告应准确、清晰、明确和客观； 定性测定报告“阴性”或“阳性”，定量测定则以拷贝数/ml或IU/ml报告，避免二者的混淆； 每份报告应包括以下信息：标题，如“检测报告”、报告的唯一标识（如序号）、被检测标本的说明、检测标本的特性和状态、检测标本的接收日期和进行检测的日期、采用的检测方法、实验操作及校核人员的签字及签发日期、检测报告中应给出参考结果或范围（检测下限）； 5.8 结果报告(2-2) 由于任何原因导致报告的有效性发生疑问时，实验室应立即通知临床相关科室予以改正； 当临床科室或患者要求用电话、图文传真或其它电子和电磁设备传送结果时，实验室应保证工作人员遵循文件化的程序，并为对方必威体育官网网址。 定量PCR试验HCV-RNA使用GBW09151标准物质验证准确性，定值1.09±0.27×105 IU/ml,实测0.79×105 IU/ml，偏差27.5%，超出定值范围，未进行处理（5.6.3）。 （0.79－1.09）/1.09*100% = 27.5% 假定一个靶值为1*104; 如果检测结果为1*103，则（1*103 -1*104）/ 1*104 =0.9=90%; 如果检测结果为1*105，则（1*105 -1*104）/ 1*104 =9=900%。 不符合项案例 HBV-DNA可报告范围为103－108，HCV-RNA可报告范围为103－107，标准曲线和室内质控的浓度设定都在104以上，建议观察103低浓度值。（5.6.1）。 观察项案例 扩增及产物分析区（3区） 实验前 ? 打开通风设备 ? 实验台面清洁（水或70%酒精擦拭） ? 实验室温度： ℃（允