HIF1α对缺氧状态下近曲肾小管皮细胞的作用和分子机制的研究.docx

2010复旦大学博士学位论文 摘要 第一部分： 建立近曲肾小管上皮细胞的缺氧模型 背景和目的：急性肾损伤是一种常见的临床综合征，也是危重症患者常 见的并发症和重要的死亡原因。缺血性损伤是急性肾损伤的主要发病机 制，而缺氧是缺血性损伤中最为关键的环节。肾脏的管状上皮细胞的高 水平氧耗量及肾脏的特殊脉管系统结构使得肾脏对缺氧非常敏感，而且 近曲肾小管上皮细胞对缺血性损伤尤为敏感。因此，肾小管上皮细胞的 缺氧性损伤最为关注，是学术界研究的焦点。铁螯合剂二氯化钴(CoCl2) 是常用的化学缺氧的模拟剂，在国内外实验研究中已获得广泛应用。建 立一个稳定的细胞缺氧模型，为后续研究工作的开展具有重要的意义。 本研究旨在通过比较不同CoCl2浓度和不同缺氧时间时细胞的生长抑 制率和缺氧诱导因子．1a(HIF．1仅)蛋白表达量，来确定后续研究中细 胞的最佳缺氧条件。 材料和方法：选取人的近曲肾小管上皮细胞系(HK．2)为实验细胞。 实验性缺氧方法为细胞缺氧，即在细胞培养液中加入CoCl2。使用含不 同CoCl2浓度的培养液(终浓度分别为O、50、l 00、l 50、300、600“M) 培养HK．2细胞，并分别缺氧培养不同时间(O、4、6、1 2、24、48h)， 尔后应用MTT试验检测细胞的生长抑制率，同时收集细胞提取核蛋白 进行Western免疫印记定量法检测细胞中HIF．1 a蛋白表达量。 结果：1)随着细胞培养液中CoCl2浓度的增加，细胞的生长抑制率呈 现增加趋势；随着缺氧时间的延长，细胞的生长抑制率也呈现增加趋势。 经统计发现，细胞培养液中CoCl2浓度在50～300pM与600pM时，细 胞的生长抑制率有显著性差异(尸0．05)，而CoCl2浓度在50～300pM 时，虽然细胞的生长抑制率呈递增趋势，但是差异无统计学意义 (PO．05)。同时，还发现缺氧时间为48h时，细胞的生长抑制率显著 高于4～24h(尸0．05)；而在缺氧时间为4～24h时，虽然细胞的生长 抑制率亦呈递增趋势，但是差异无统计学意义(尸0．05)。 2)在缺氧时间为O～24h之间，随着时间的延长，HIF．1 a蛋白表达量 渐增加，至24h达到峰值，48h时HIF．1仅蛋白表达量较24h减少；当 CoCl2浓度为O～1 50“M时，随着CoCl2浓度的增加，HIF．1 0【蛋白表达 量渐增加??当CoCl2浓度达到150“M时，HIF．1a蛋白表达量较CoCl2 浓度为300和600“M时亦高。 结论：最佳缺氧处理条件为细胞培养液中CoCl2终浓度为1 50pM，缺氧  2010复旦大学博士学位论文 时间为24h，此时对HK．2细胞的活力影响较小，而且细胞中HIF．1 0【蛋白 的表达量最多。构建理想的细胞缺氧模型为后续研究工作的开展提供了 坚实的基础。 关键词：近曲肾小管上皮细胞；氯化钴；缺氧诱导因子．1a；急性肾损 伤 4  2010复旦大学博士学位论文 第二部分： HIF．1伉siRNA转染近曲肾小管上皮细胞 背景和目的：基因沉默是广泛存在于生物界的古老现象，是生物体抵御 病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制，广泛存 在于真核生物细胞中。RNA干扰(RNAi)作为一种新的基因沉默的方 法，在基因功能的研究上呈现出巨大的应用前景。应用RNAi特异性地 沉默基因来研究该基因的功能的方法已经被国内外学者广泛接受。 RNAi具有高度特异性、高效性和安全性的特点，它可以在既不破坏基 因结构又不引起基因突变的情况下，敲除某基因，以研究其功能。然而， 不同的哺乳动物细胞的转染效率会有所差别，在实验中需要对每一种细 胞系选择合适的转染试剂和最佳的转染条件。适量的转染试剂和siRNA 的最佳终浓度对RNAi基因沉默的效率起着重要作用。本研究旨在评估 转染试剂转染siGLO的效率和确定HIF．1 0【siRNA沉默HIF．1 q的最佳 浓度。 材料和方法：RNAi的试剂主要包括SMARTpool HIF．1a siRNA、siGLo siRNA阴性对照和DharmaFECT 1转染试剂，购自美国Dharmacon公司。 转染方法按照公司提供的Protocol进行操作。应用激光共聚焦荧光显微 镜观测转染效率；应用荧光定量PCR法进行定量分析细胞中HIF．1 a mRNA的表达量。 结果：1)4“l转染试剂和终浓度1 oonM siGLO转染指示剂(即转染试 剂与siGLO的比例为4“l：0．2nm01)转染细胞时可以获得95％～1 00％ 的转染效率。 2)HIF．1a siRNA终浓度分别为25、50和100nM时，HIF．1a siRNA沉 默HIF．1a mRNA的效率分别为24．0士8．6％、43．0士4．2％和70．0士4．2％。 3)沉默H