MS4A7基因在U审审937细胞分化中的差异表达及其启动子研究.docx

天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的： 研究急性单核细胞白血病细胞系U-937分化前后MS4A7基因表达水平的变 化情况。揭示其与白血病不同阶段的相关性。研究调控MS4A7基因表达的主要 信号通路，揭示异常细胞信号转导引起白血病和MS4A7基因表达异常的相关性。 构建含有MS4A7基因启动子的虫荧光素酶报告基因质粒，建立启动子区缺失片 段的报告基因质粒，研究MS4A7基因启动子区的启动活性片段，以及调控 MS4A7启动子区转录活性的转录因子。 方法： 1．50nmol／L佛波酯(PMA)刺激6孔板培养的U．937白血病细胞系，在诱导刺激 的0、1、3、5d后收集总RNA，反转录为cDNA后实时荧光定量PCR检测 细胞内MS4A7基因mRNA表达量的改变。 2．ERK抑制剂U0126、p38 MAPK抑制剂SB230580、JNK抑制剂SP600125分 别预处理U．937细胞6h，第一组处理后加入PMA，第二组不加PMA，两组 细胞均作用48h后收集总RNA，反转录为cDNA后实时荧光定量PCR测定 两种处理后对MS4A7基因的mRNA表达水平的影响。 3．PCR扩增MS4A7基因启动子区片段(．1536bp~+164bp)，通过双酶切反应将 MS4A7基因启动子片段和虫荧光素酶载体pGL3．Basic定向连接，得到 pGL3．MS4A7．Promoterl～5重组质粒。重组子序列经双酶切、测序鉴定得到 确认。将pGL3．MS4A7．Promoter系列重组质粒转染入细胞白血病细胞系 (甩．60、U．937)和非白血病细胞系(HeLa、SKOV．3)，通过检测细胞中虫 荧光素酶的活性探究MS4A7启动子活性片段。 4．建立基于实时荧光定量PCR分析的染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，CHIP)方法初步探讨转录因子ATF2和ELKl对MS4A7 基因启动子的调控作用。 结果： 1．U．937在50nmol／LPMA刺激24h后MS4A7基因mRNA表达量升高俨o．05)， 并随着刺激时间的延长和细胞的分化，表达进一步增强，35d表达量维持 恒定(P0．05)。 2．与正常培养细胞的MS4A7基因mRNA水平相比，抑制剂U0126、SP600125  天津医科大学硕士学位论文 直接处理的细胞MS4A7基因表达水平的差异无统计学意义(例．05)，抑 制剂SB230580处理的细胞MS4A7基因表达降低(尸0．05)；与PMA分化 后的MS4A7基因表达水平相比，U0126、SP600125预处理的细胞加入PMA 以后，MS4A7基因表达量无统计学意义；SB230580预处理的细胞加入PMA 以后，MS4A7基因表达量降低(氏O．05)。 3．构建的含有MS4A7基因系列启动子缺失片段的虫荧光素酶报告基因 pGL3．MS4A7．Promoterl～5经双酶切和测序验证后，证明插入的启动子序列 正确：将重组的pGL3．MS4A7．Promoter转染到白血病细胞系HL．60、U．937 和非白血病细胞系HeLa、SKOV-3后，通过虫荧光素酶活性检测发现MS4A7 启动子活性在两种细胞内有明显差异。在白血病细胞系中，MS4A7基因启动 子活性虫荧光素酶在．1536bp卜704bp的区域活性最强。 4．ATF2抗体和ELKl抗体沉淀过的DNA经实时定量PCR没有检测到MS4A7 启动子的扩增信号。 结论t 1．PMA诱导的U．937细胞分化为巨噬细胞以后，MS4A7基因表达水平明显升 高，提示MS4A7基因在细胞分化中有重要作用。 2．MS4A7基因表达与p38 MAPK活化有密切联系，MS4A7基因的主要功能为 参与细胞成熟过程中的信号传导，结合p38 MAPK在造血细胞分化中的功能 我们认为，p38 MAPK参与PMA介导的U一937细胞分化的过程，而这是由 幼稚细胞转向分化较为成熟的巨噬细胞的过程，这表明在p39MAPK通路激 活的同时，其下游的转录因子也被激活，而这些转录因子有可能是启动 MS4A7基因表达的关键的转录因子。 3．MS4A7基因启动子的活性在白血病细胞系与非白血病细胞系显示出明显差 异。在白血病细胞系中，启动子的．703bp～79bp区域的启动子活性较弱，而 ．1536bp704bp的区域启动子活性最强，揭示此区域对于基因的转录起到重 要作用。 4．尚不能认为MS4A7启动子区存在与转录因子ATF2和ELKl的结合位点， 调控MS4A7基因表达的转录因子需要进一步研究。 关键词：MS4A7细胞分化信号传导启动子虫荧光素酶报告基因载体染色 质免疫共沉淀 II  天津医科大学硕士学位论文 Abstract OBJECTⅣE： To study the differ