PAMAMNK4纳米复合物的备及对乳腺癌体内外生长抑制的研究.docx

硕士学位论文PAMAM．NK4纳米复合物的制备及对乳腺 硕士学位论文 PAMAM．NK4纳米复合物的制备及对乳腺 癌体内外生长抑制的研究 硕士研究生：延艳 指导老师：叶长生教授 摘要 研究背景： 乳腺癌是目前全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全世界范围内 均呈现上升趋势，对女性的健康造成严重威胁。自90年代以来，中国乳腺癌发 病率的增长速度已经达到了全球的两倍多，成为中国女性恶性肿瘤发病率的第 一位。随着对基因组学、蛋白组学和分子生物学研究的不断深入，人们已经逐 步意识到癌症的发生与演变是多种癌基因共同作用的结果，乳腺癌的基因治疗 成为研究的热点。基因治疗成功的决定性因素是高效的基因转染和表达，因此 目的基因和载体的选择至关重要。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)由间质细胞产生，通过 与受体c．Met结合，发生自体磷酸化，促进肿瘤的增殖、侵袭、转移以及血管形 成。有文献报道HGF的高表达在乳腺癌的发生、发展和侵袭、转移中发挥了重 要作用。NK4首先是作为特异性HGF拮抗剂被发现的，由HGF的N末端氨基 酸和4个Kringle区域组成的NK4作为HGF的一部分，能够竞争性拮抗HGF 与c．Met结合以及抑制新生血管生成，从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移， 具有显著的抗肿瘤作用。已有实验证明NK4对胰腺癌、宫颈癌、肝癌等多种恶 性肿瘤具有抗肿瘤作用，并在裸鼠动物模型上得到验证。 准确地将目的基因导入肿瘤细胞中，载体的选择至关重要。聚酰胺一胺树枝 状高聚合物(polyamidoamine dendrimers，PAMAM)是目前应用最广泛的多聚 万方数据 中文摘要阳离子聚合物之一。其表面的氨基基团(—．NH2)可以与DNA主链的磷酸基团 中文摘要 阳离子聚合物之一。其表面的氨基基团(—．NH2)可以与DNA主链的磷酸基团 产生静电作用，形成稳定的复合物，既提高了目的基因的转运效率，又提高了 PAMAM．DNA纳米复合物的稳定性。此外它还具有以下优势：①不会因免疫原 性使机体产生免疫反应：②无遗传毒性和细胞毒性；③可以保护目的基因转染 后不受机体中血浆、组织细胞中的各种补体以及多种酶的破坏，从而延长其在 细胞内的停留和表达时间。 目的： 选取第5代PAMAM作为基因载体，制备PAMAM-NK4纳米复合物，检测 纳米复合物的转染效率并考察其体外对乳腺癌细胞的抑制作用。建立人乳腺癌 细胞裸鼠移植瘤模型，观察PAMAM．NK4纳米复合物体内的抗癌效果，为乳腺 癌基因治疗的临床研究提供理论基础。 方法 1．PAMAM—NK4纳米复合物的制备、转染及鉴定 1．1人乳腺癌MCF一7、MDA—MB一23 1细胞株的培养 购买的人乳腺癌MCF．7、MDA．MB．23 l细胞株更换含血清的培养液后，放 置在37℃，5％C02培养箱中常规培养，显微镜下判断细胞状态，定期更换培 养液。 1．2 PAMAM-NK4纳米复合物的制备 将提纯后的第5代PAMAM和重组质粒pcDNA3．1-NK4按照5：1的电荷比 置于PBS溶液中，震荡混合15s，室温下静置30min。 1．3转染人乳腺癌MCF．7、MDA．MB．23 1细胞株 制备浓度为100 nmol／L的PAMAM．NK4悬液，分别取2 ml悬液转染对数生 长期的MCF一7、MDA—MB．231细胞株，放置在孵箱中常规培养。4 h后更换含 10％胎牛血清的DMEM培养液，继续培养。 1．4体外转染率的检测 将转染后的两种细胞株继续培养，24h后置于倒置荧光显微镜下观察，绿色 万方数据 硕士学位论文荧光的细胞为转染阳性的细胞，计算转染率。 硕士学位论文 荧光的细胞为转染阳性的细胞，计算转染率。 2．PAMAM-NK4纳米复合物对乳腺癌细胞的体外抑制作用 2．1 MTT检测PAMAM．NK4纳米复合物转染对乳腺癌细胞增殖的抑制作用 将对数生长期的MDA—MB．231、MCF一7细胞株分为对照组、空质粒组 (PAMAM组)和实验组(PAMAM-NK4组)，每孑L加入MTT溶液40¨l，4 h 后去上清。加入1509iDMSO，震荡10min。测OD值，增殖抑制率(％)=(1一 实验组OD值／对照组OD值)×100％。 2．2 Western blot检测PAMAM-NK4纳米复合物转染对乳腺癌细胞NK4蛋白表达 的影响 取培养至对数期的对照组、空质粒组和实验组细胞，提取各组细胞蛋白， 在酶标仪上测蛋白浓度。样品经SDS．PAGE电泳分离总蛋白条带、转膜和封闭 后，加入NK4一抗(人HGF单抗)4℃过夜，TBST洗3次，再加入二抗，13-actin 为内参。洗膜后显影、扫描胶片、分析条带的灰度值。 2．3流式细胞术检测