HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互用分析.docx

HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究摘要 HPS自转运蛋白的免疫原性及其与宿主细胞相互作用研究 摘要 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)作为猪上呼吸道的一种常在菌，在特定条 件下可以侵入机体引起全身性疾病。近年来，该病给全球养猪业造成巨大经济损失， 同时也引起了研究者的关注。目前，虽然有大量针对副猪嗜血杆菌的研究报道，寻 找出许多毒力候选基因，但我们对副猪嗜血杆菌致病机制的了解还十分有限。 革兰氏阴性细菌V型蛋白分泌系统，也称为自转运蛋白。该蛋白主要由3部分 组成，包括信号肽，N端的passenger结构域(passenger domain)和C端的p结构域(13 domain)，其中passenger结构域是其发挥功能的部分。研究表明，该蛋白与细菌的 粘附、入侵、细胞毒性有关，可介导生物被膜的形成和血清抗性的产生，因此被认 为是病原微生物的一种重要的毒力因子。 为探究自转运蛋白在副猪嗜血杆菌的致病过程中可能起到的作用，本论文将副 猪嗜血杆菌SH0165菌株中发现的两个自转运蛋白基因at2和at3作为研究对象，运 用PCR、原核表达、单克隆抗体、蛋白免疫印迹等技术开展研究。主要研究结果如 下： 1．at2、at3，at2．passenger domain(at2一pcO和扔一passenger domain(atS-pd)的克隆 及相应蛋白的原核表达 以SH0165菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增at2、at3，at2-pd和at3-pd， 四个片段大小分别为2336bp、2443bp、1368bp和1392bp，分别编码771、780、450 和458个氨基酸。将at2、at3分别与pET．30a连接，at2-pd、at3-pd分别与pET-28a 连接，连接产物转化E．coli／DH5a菌株，将测序正确的质粒再转化E．coli／BL21(DE3) 菌株并进行原核表达。结果成功克隆了上述4个片段并构建了其相应的原核表达载 体，在E．coli／BL21(DE3)菌株中实现了上述4种蛋白的原核表达，分别命名为AT2、 AT3、AT2．PD和AT3．PD。 2．AT2．PD和AT3一PD蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备 在E．coli／BL21(DE3)菌株中表达的AT2．PD和AT3。PD蛋白以可溶性的形式存 在，利用蛋白融合表达的组氨酸标签对蛋白进行纯化。使用纯化的蛋白免疫BALB／c 鼠进行单克隆抗体的制备工作。结果AT2．PD蛋白获得5株能产生单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，分别命名为1E4、3C9、3D8、3E8和4810；AT3．PD蛋白获得5株能 产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2E6、3H8、4C8、4F12和4H10。间 接ELISA和Western．blot分析表明抗体特异性良好，其中4810的效价为1：102400： 4H10的效价为1：25600，这两份单克隆抗体用于后续实验的开展。 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文3．AT2和AT3蛋白在E．coli／BL21(DE3)和SH0165上的定位分析 华中农业大学2011届硕士研究生学位论文 3．AT2和AT3蛋白在E．coli／BL21(DE3)和SH0165上的定位分析 利用获得的单克隆抗体结合Western-blot实验分析AT2和AT3蛋白分别在 E．coli／BL21(DE3)．AT和SH0165上的定位情况。分别提取这两种细菌的细胞总蛋白， 细胞膜总蛋白和分泌蛋白。结果显示，AT2和AT3蛋白分别存在于表达该蛋白的 E．coli／BL21(DE3)菌株的细胞总蛋白，细胞膜总蛋白和分泌蛋白中；AT2蛋白存在于 SH0165的细胞总蛋白和细胞膜总蛋白中；AT3蛋白存在于SH0165的细胞总蛋白、 细胞膜总蛋白和分泌蛋白中。 4．AT2和AT3蛋白的免疫原性分析 由于AT2和AT3蛋白在SH0165是细胞膜蛋白和／或分泌蛋白，故对其免疫原 性进行分析。首先检测其在15株HPS标准血清型菌株中的分布情况，实验表明口垃 基因除在标准血清型4型菌株中未扩增出相应条带外，其余均可扩增出相应条带； at3基因在所有标准血清型菌株中均可扩增出相应条带。利用纯化的AT2．PD和 AT3．PD蛋白作为抗原包被酶标板，使用7份不同血清型菌株攻毒猪后获得的感染 血清进行间接ELISA实验，．结果显示为阳性；同时利用Western-blot对该7份血清 中针对AT2．PD和AT3．PD的抗体也进行了检测，结果也显示为阳性。 5．AT2和AT3蛋白分别与细胞相互作用 使用分别表达AT2和AT3蛋白的E．coli／BL21(DE3)菌株分别与猪髋动脉内皮细 胞、猪肺细胞、猪气管上皮原代细胞进行粘附与粘附阻遏实验，结果显示这两种细