HSPAA和HSPA8在分娩中的功能研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docx

HSPAl．4和HSPA8在分娩中的功能研究 目 录 摘要 一i Abstract ． ．． ．．．． ．． ． ． ．．．．．．．．．． ．．．．． ． ． iii 中英文缩写对照表 ．v l前言 ．1 1．1热休克蛋白的简介 ．．2 1．2热休克蛋白70简介 2 】．3 HSP70的生物学功能 5 1．4 HSP70与分娩启动 6 1．5 HSPAlA和HSPA8的研究进展 ．．9 1．5 PFT-¨和LPS ．．11 1．6课题的目的与意义 ．1 1 2材料与方法 13 2．1载体和菌株 13 2．2主要试剂和仪器 13 2．3主要溶液的配制 ．14 2．4 PCR扩增产物的检测和回收 ．15 2．5表达载体的构建及酶切回收 16 2．5．1 pMDl8．T载体连接与转化 ．16 2．5．2质粒的提取 ．17 2．5．3重组表达质粒的构建 ．18 2．5．4提取去内毒素重组表达质粒 ～19 2．6细胞培养 20 2．6．1细胞的复苏 ．20 2．6．2细胞的常规培养 ．．20 2．6．3细胞冻存 ．．2l 2．7细胞转染 ．22 2．8细胞总RNA的提取 ～22 万方数据  华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 2．9实时荧光定量分析 。 ．．23 2．10 Western Blot试验步骤 26 2。10。1蛋白提取 26 2．10．2 SDS．PAGE电泳 ．27 2．10．3转膜 28 2．10．4抗原抗体免疫反应 28 2．1 l ELISA 29 2．12免疫组化过程 30 2．12．1石蜡切片免疫组化试验步骤 30 2．12．2活体试验的实施方案： 3l 2．13主要数据库及分析软件 31 2．14统计学分析 3l 3结果与分析 32 3．1 HSPAlA和HSPA8基因真核表达质粒的构建 ．32 3．2 HSPAlA和HSPA8转染WISH细胞超表达和干涉的效率 ．32 3．3 HSPAlA和HSPA8参与分娩启动的可能的信号通路和生物学过程 ．35 3．4 HSPAlA和HSPA8通过ERKl／2调控雌激素受体口(勰2)的表达 ．．35 3．5 HSPAlA在活体中诱导足月和早产分娩 ．．39 4讨{仑 41 4．1 HSPAlA和HSPA8刺激免疫炎症反应诱导分娩 ．4l 4．2 HSPAlA和HSPA8增强雌激素响应诱导分娩 ．42 5结{仑 一j ．．45 6本研究的创新之处 46 7本研究的不足之处 46 8进一步研究计划 46 参考文献 47 研究生在读期问发表的主要论文 58 致谢 一59 Ⅱ 万方数据  HSPAIA和HSPA8在分娩中的功能研究 摘要 参与分娩启动的机制和因素有很多，包括细胞凋亡、免疫炎症调控因子和激素。 然而，具体的作用机制尚不清楚。HSP70蛋白是热休克蛋白家族中最重要的成员之 一，有多种生物学功能。有报道称HSP70直接或间接参与细胞凋亡，免疫炎症反应 和激素刺激响应。 为了探索HSP70参与分娩启动的分子机制，我们通过转染HSP70家族两个代 表性基因(删埘和删8)的人重组质粒和其si—RNA于人羊膜上皮细胞(WISH 细胞)，过表达和敲低两个基因。然后通过Western blot和RT．PCR分析，检测几个 通路的标志基因表达变化(细胞凋亡：BAR,BCL2和FAS；免疫炎症反应：TLR4、 TAPl和见．占；雌激素刺激响应：E踩2)。结果表明在WISH细胞中，HSPAlA和 HSPA8的过表达下调BAX,FAS、BAG2初ESR2，上调BCL2、TLR4、TAPl、CHIP 和见．8；HSPAlA和HSPA8表达的敲低上调BAX,FAS、BAG2和ESR2，下调BCL2、 TLR4、TAPl、CHIP和儿．8。初步表明了HSPAlA和HSPA8有抗细胞凋亡的性质， 并且参与免疫炎症反应以及雌激素信号通路。也即HSPAlA和HSPA8可能通过细胞 凋亡、免疫炎症反应和雌激素刺激响应参与分娩。另外，定量和Western blot的结果 表明，基因表达水平变化最剧烈的是乜一8和ESR2。然后，通过使用ERKl／2磷酸化 特异性抑制剂一PD98，059，处理WISH细胞，以及通过ELISA分析雌二醇(E2)的 变化情况。结果表明，HSPAlA和HSPA8可以通过抑制ERKl／2的磷酸化调控ESR2 的表达，进而影响雌激素刺激的响应。 最后，通过对妊娠15天的孕鼠腹腔注射LPS，构建早产鼠模型。用HSPAlA 的特异性抑制剂一PFT—gt处理LPS诱导的早产鼠模型，取小鼠胎膜进行免疫组化。 结果表明，当仅用PFT—p处理孕鼠时，IL．8的表达下降而ESR2的表达上升：当用 PFT-g处理LPS诱