Cripto1瘤基因高达在肝癌发病机理中的作用及其临床意义.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 南方医科大学 硕士学位论文 Cripto-1瘤基因高表达在肝癌发病机理中的作用及其临床意义 姓名：李艳青 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：姚开泰硕士学位论文Cripto-1 硕士学位论文 Cripto-1瘤基因高表达在肝癌发病机理中的 作用及其临床意义 硕士研究生：李艳青 硕士生导师：姚开泰教授 指导老师：肖 东研究员 摘 要 研究背景和研究目的： 肝细胞肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差，探索肝细胞 肝癌的发病机制是临床研究的重大课题。研究表明，CR-1在早期胚胎发生尤其 是干细胞自我更新、维持多向潜能及生存方面发挥关键作用的基因，往往也与 恶性肿瘤的发生发展存在着密切的关系。癌胚基因Cripto．I(CR-1)在胚胎发育和 肿瘤发生发展及转移过程中发挥多项重要调节作用，在乳腺癌、肺癌、胃癌和 结直肠癌等肿瘤中异常高表达，且其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及 复发成正相关，与预后成负相关。体内、体外实验均证明：拮抗CR-1的反义寡 核苷酸及中性封闭CR-1的单克隆抗体能强烈抑制结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、睾 丸癌及白血病癌细胞的生长。迄今，CR-1在肝癌中的作用尚不清楚，为此本课 题将揭示CR-1在人肝细胞肝癌患者肝癌组织和肝癌细胞株上的表达谱，并利用 肝脏特异表达人CR-1的转基因小鼠探讨CR-1在人肝癌发病机制中的作用，为 进一步认识肝癌发病的分子机制和寻找新的早期诊断及治疗靶点提供线索和依 据，具有较大的科学意义和社会价值。 摘要方法 摘要 方法 1．人肝癌组织和肝癌细胞株上CR-1表达水平检测 采用荧光定量PCR、RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法检测人原发性 肝癌组织标本CR-1表达；应用引物UNA、UNB和UND检测人肝癌细胞系HepG2、 Huh-7、SK-Hep．1和PLC中CR-l中mRNA转录本。 2．运用RCLG转基因小鼠解析CR-1在肝癌发生发展中的作用 RCLG转基因小鼠与Alb．Cre转基因小鼠交配而获RCLG，Alb-Cre双转基因 小鼠，进而Cre介导重组在双转基因小鼠肝脏实现转基因CR-1过表达，随后在 不同时间点(3周、3月、6月和8月)采集小鼠肝脏组织进行组织病理分析及其它 相关检测与分析，以明确CR-1在肝癌发生发展中的作用及相关机N- ①RT-PCR检测RCLG／Alb．Cre双转基因小鼠肝脏中CR-1表达水平； ②取材过程中进行肝脏大体观察； ③基于RCLG／Alb．Cre双转基因小鼠肝脏组织石蜡切片进行HE染色，而后进 行病理分析，明确双转基因鼠肝脏病理变化(囊臆鬻、骚增黛嚣鬃塑矮 戮藜黼)； ④借助BrdU或EdU标记进行细胞增殖检测以对双转基因鼠肝脏细胞增殖情况 进行评价：在处死实验小鼠前4h，腹腔注射EdU(100 mg／kg body、m； ⑤采用荧光定量PCR检测相关基因(如TGF．131、Notchl、IL．6、IL．1D等)表 达水平变化，进一步确认如上病理变化； ⑥根据组织病理变化确定合适时间点，采集双转基因鼠肝脏组织，并提取总 RNA，进而采用高通量方法(如基因表达谱芯片)筛选小鼠肝脏过表达转基因 CR-1后的差异表达基因，以明确与肝癌发生发展密切相关的基因和信号通路 等； ⑦针对“⑥”中筛选出的可能在肝癌发生发展过程中起重要作用的特定基因和信 号通路，采用常规分子生物学技术与方法进一步确认其具体作用及分子机 制。 Ⅱ 硕士学位论文量士 硕士学位论文 量士童拿日术 1．人肝癌组织和肝癌细胞株上CR-1表达情况 1．1 RT-PCR检测CR-I在人肝癌组织中的表达 共收集21例原发性肝癌组织标本、18例癌旁标本。CR-I在肝癌及癌旁组织 标本中主要表达1．7kb的短转录本，2kb的长转录本仅有少量表达。根据电泳图各 条带的CR-1灰度值与GAPDH灰度值比率计算样本中CR-1表达水平，21例肝癌组 织中有15例高表达。 1．2荧光定量PCI己检测CR-1在肝癌组织中的表达 采用荧光定量PCR检测CR-l基因在肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织中表 达情况，进一步验证半定量RT-PCR的结果，结果表明荧光定量PCR结果与半定 量RT-PCR结果一致。 F 1．3 Western bIot检测CR．1在肝癌组织中的表达 番 CR-1在肝癌组织中表达水平明显高于同一病人的癌旁组织，采用ImageJ软 件分析CR-1的表达与内参基因的灰度比值，最高的有16倍，最低的也有2倍以上， 这种表达差异可能与肝癌细胞分化程度相关，需进一步统计分析。 1．4免疫组织化学检测CR-1在肝癌组织标本中的表