IL8介导血平滑肌细胞迁移机制及G31P的作用初探.docx

大连医科大学 硕士学位论文 IL-8介导血管平滑肌细胞迁移机制及G31P的作用初探 姓名：孙云亮 申请学位级别：硕士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：高颖 201106 I I L一8介导血管平滑肌细胞迁移机制及G31 P的作用初探 硕士生姓名：孙云亮 指导教师：高颖教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘要 目的：动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)导致的心脑血管疾病是人类健康 的最大杀手，在我国的发病率逐年升高。近年来的研究表明AS是一种炎症性疾病， 大量的炎症细胞和炎性因子伴随在其发生和发展过程的始终。炎症细胞参与AS表 现为在损伤部位有大量炎症细胞的粘附、浸润，并且释放大量的炎性因子，趋化 自细胞穿过血管内膜，诱导平滑肌细胞表型改变，继而迁移进入内膜并进行增殖。 这些细胞进入内膜后，开始吞噬脂质形成泡沫细胞，加速AS的发展。趋化因子是 ～类具有趋化作用的小分子量分泌型蛋白，可以诱导白细胞进入血管内膜，在AS 中发挥重要作用。自细胞介素．8(Interleukin．8，IL．8)是一种单核／巨噬细胞分泌的 多肽，通过与其受体CXCRl／CXCR2结合从而启动中性粒细胞趋化反应。IL．8还 能够诱导入主动脉血管平滑肌细胞迁移和增殖；并且可以促进AS中新生血管形 成，但其具体机制尚不清楚。抑制IL．8与其受体结合为治疗AS提供了新的思路。 G31P是通过对人IL．8基因的定点突变，筛选的出高亲和力，无活性的人IL．8类 似物。通过实验证实了G31P可以高效的亲和CXCRl／CXCR2，对与中性粒细胞相 关的感染治疗上有明显的疗效。G31P对中性粒细胞CXCRl／CXCR2的有效抑制作 用能否发生在血管平滑肌细胞中尚未有研究。 方法： (1)利用RT．PCR的方法检测A7r5细胞中是否有IL．8的受体之一 CXCR2的表达；(2)利用Boyden Chamber法观察IL．8和G31P对A7f5细胞迁移 的影响； (3)利用划痕法和Boyden Chamber法观察G31P在IL．8诱导A7r5细胞 迁移过程中的影响； (4)利用细胞免疫荧光方法观察细胞骨架变化情况； (5)利 用钙离子荧光探针Fluo．3 AM检测IL．8与G3 1P对A7r5细胞内钙离子浓度的影响。 结果： (1)RT-PCR结果显示A7r5细胞中有CXCR2的表达； (2)IL．8诱 导A7r5细胞迁移实验结果显示，随着IL一8浓度的增加，细胞迁移数呈现上升趋势， IL-8浓度为20ng／ml、50ng／ml两组的细胞迁移数较其它各组有统计学意义，但这 两组之间差异无统计学意义。随着G31P浓度的增加，迁移的细胞数并未发生明显 变化，各组间的差异无统计学意义。(4)划痕和迁移实验结果显示了细胞平均迁 移距离与相对迁移数量两项统计值的变化情况，只用G31P处理的阴性对照组与空 白对照组比较，两项统计值的变化均无统计学意义。只用IL．8诱导的阳性对照组 白对照组比较，两项统计值的变化均无统计学意义。只用IL．8诱导的阳性对照组 与空白对照组比较，两项统计值的变化均有统计学意义(po．01)。G3 1P抑制组 与空白对照和G31P阴性对照组比较，两项统计值的变化无统计学意义；与IL．8 阳性对照比较，两项统计值的变化有统计学意义(pO．01)。 (5)免疫荧光实验 结果显示，随着IL．8浓度增加，细胞伪足伸出明显增加，呈剂量依赖趋势。与未 用G31P预处理、IL．8终浓度为20ng／ml组的细胞相比，在用G31P预处理后再用 IL．8刺激，可观察到细胞伪足的伸出不明显。(6)细胞内钙离子浓度测定结果显 示，随着IL．8浓度的增加(0．100ng／m1)细胞内钙离子的荧光强度逐渐增加，呈 现剂量依赖趋势，与对照组相比有统计学意义。与用同样浓度的几-8刺激组相比， 用G31P预处理的细胞、再用IL．8刺激后，其细胞内钙离子的荧光强度变弱，有 统计学意义。 结论：(1)IL．8可以诱导A7r5细胞的迁移、细胞伪足伸出、细胞内钙离子 浓度升高，具有剂量依赖性。(2)G31P可以有效抑制IL．8对A7r5细胞的诱导作 用。 (3)IL．8对A7r5细胞的诱导作用可能通过调节细胞膜钙离子通道进而调节 细胞功能。 关键词：IL．8 G31P A7r5细胞动脉粥样硬化细胞迁移趋化因子 2 Role Role of G3 1 P in smooth muscle migration of A7r5 Cells induced by interleukin-8 Master degree candidate：Yunliang Sun Supervisor：Professor Ying Gao Maj or：Bioche