IL审15慢病毒表达载体的构建及体外实验.docx

天津医科火学硕士学位论文 中文摘要 目的： 构建慢病毒IL-15基因表达载体，包装IL—15基因表达慢病毒，体外 感染肿瘤细胞，使之能够高效地表达IL-15，达到增强免疫效应的目的。 方法： (1)构建慢病毒IL—15基因表达载体：首先进行质粒双酶切，将GFP 编码序列从慢病毒质粒CS-CDF-EG—PRE(LO)上撤除，然后利用PCR技术，以质粒 pHi2一spILl5一CMV—TAT(L3)为模板扩增IL一2SP—IL—15的编码基因，将其定向 克隆于质粒CS-CDF-EG-PRE(LO)中，构建质粒CS—CDF-EF一。-spILl5-PRE(LTl5)。 (2)以含GFP表达质粒CS-CDF-EG—PRE(L0)为对照质粒，CS—CDF—EF-,-spiLl5一PRE (LTl5)为表达质粒，利用脂质体介导的方法分别转染293细胞、SW480细胞和 MCF-7细胞。(3)以CS-CDF—EG—PRE(L0)为对照质粒，CS—CDF—EEl-spiLl5一PRE (LTl5)为表达质粒，与其他三种辅助质粒pMDL／pRRE(L7)、pRSV—Rev(L8)、 pMD．G(L9)共转染293T细胞，包装含GFP、IL—15基因的两种慢病毒载体，分别 感染Hela细胞。(4)利用倒置荧光显微镜观察细胞转染后绿色荧光的表达，流 式细胞术(FCM)分析检测细胞的转染效率，酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞 转染后24及48小时上清液中IL-15的浓度，分析IL-15基因的表达情况。 结果： (1)质粒pHi2一spiLl 5-CMV—TAT(L3)、CS—CDF—EG—PRE(LO)、 CS-CDF-EF-l_spILl5-PRE(LTl5)经限制性(单、双)酶切，PCR检测及测序分 析，证实IL-15表达质粒构建成功。(2)质粒CS-CDF—EG—PRE(LO)和 CS-CDF-EF-1--spILl5-PRE(LTl5)利用脂质体介导的方法均可转染293T细胞、 SW480细胞和MCF-7细胞，转染效率为35．3％。(3)以CS—CDF—EG—PRE(L0)为对照 质粒，CS—CDF—EF一。-spILl5-PRE(LTl5)为表达质粒粒，与其他三种辅助质粒 pMDL／pRRE(L7)、pRSV—Rev(L8)、pMD．G(L9)共转染293T细胞，成功包装了含GFP、 IL一15基因的两种慢病毒，并分别感染Hela细胞，验证了慢病毒载体的活性。 (4)ELISA检测结果：PBS转染组及质粒CS—CDF-EG-PRE(LO)和GFP慢病毒转染 肿瘤细胞后，均无I卜15的表达；质粒as—CDF-EF_imspiLl5一PRE(LTl5)转染 293细胞、SW480细胞和MCF一7细胞后，24和48小时后上清液中IL一15的表达 水平有显著性差异(PO．01)。293T细胞表达IL一15的量是SW480细胞和MCF一7 细胞表达量的1．6／1．5倍(24h／48h)和1．8／1．6倍(24h／48h)，SW480细胞是MCF一7 细胞的1．2／1．1倍(24h／48h)；IL-15慢病毒感染Hela细胞后，IL-15能够高效 地表达，不同剂量的慢病毒转染细胞的效率不同。  天沣医科大学硕+学位论文 结论： 成功构建了慢病毒IL一15基因表达载体，运用脂质体介导的转染方 法，将IL-15表达基因有效的导入肿瘤细胞，不同肿瘤细胞系的转基因表达有 差异性。成功制备了具有感染性的慢病毒，慢病毒感染肿瘤细胞后，IL-15能够 高效地表达，为体外转染T细胞等原代细胞奠定了基础。 关键词：肿瘤基因治疗；细胞因子；自细胞介素一15；慢病毒载体  天沣医科人学硕十学位论文 Abstract Obieetive：Construct and package IL-1 5一expression lentiviral vector，infect tumor cells in vitro for effective transgene expression for enhancing immunity． Methods：(1)Construction of lentiviral IL．15 gene expression vector：the GFP coding sequence was removed by restriction enzymes from lentiviral plasmid CS—CDF-EG-PRE(LO)，Using the plasmid pHi2一spILl 5一CMV-TAT(L3)as a template，sequence encoding IL-2SP—IL-1 5 Was amplified by PC