Flt3及41BBL分子在单核细胞和单核系源白血病细胞中的作用及其机理研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 Flt3及 Flt3及4-1BBL分子在单核细胞和单核系来源白血病细胞中的作用及其机理 中文摘要 Flt3及4-1BBL分子在单核细胞和单核系来源白血病 细胞中的作用及其机理 摘 要 Flt3表达于多能干细胞(multipotential stem ccll)、髓系和淋系前体细胞 (precursor)，而单核系的发育过程中，Fit3持续表达。Flt3信号参与了造血干 细胞的更新和定向分化。Fit3分子是目前公认的与白血病发生发展机理和治疗密 切相关的重要靶分子。4-1BBL／4-IBB为共刺激分子TNF／TNFR超家族中的重要成 员，4-1BBL分子表达于各种活化的抗原递呈细胞(APC)和活化T细胞等免疫细 胞。4-IBBL分子尚表达于某些肿瘤细胞，如自血病细胞，且与自血病细胞的生 存和增殖有关。为研究Flt3和4-1BBL逆向信号在单核细胞和单核系白血病细 胞中的作用，本研究选择共表达4-1BBL和Flt3的单核细胞与单核系白血病细 胞为研究对象，克隆表达了人全长F1t3分子并成功研制了抗人Flt3单克隆抗 体，进而探讨了其生物学特性；利用抗人Fit3抗体和抗人4-JBBL抗体，初步 探讨了Flt3信号和4-1BBL逆向信号对SHI-I细胞的生物学效应：同时还探讨了 4-iBBL逆向信号对单核细胞的作用及可能的机理。 一、 F l t3分子的克隆和转基因细胞的构建 1、人FIt3基因的克隆和逆转录病毒表达载体的构建 根据Flt3基因(OgneB址nk：Z26652)序列，以骨髓cDNA文库为模板，在 分段克隆的基础上采用人工延伸等手段获得人Fit3基因，装入PMDI 8-T-Vector 载体，转化感受态DH5a大肠杆菌。重组质粒T-Fit3经测序正确。重组质粒T-FIt3 经PCR扩增Flt3全长基因并引入PstI和BamHI酶切位点，装入逆转录表达载 体pGEZ．term，转化感受态DHSa大肠杆菌，重组质粒pGEZ-FIt3经测序正确。 2、“一箭双星”法构建FIt3转基因细胞 Flt3及 Flt3及4-1BBL分子在单核细胞和单核系来源白血病细胞中的作用及其机理 中文摘要 pGEZ-Flt3、辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后，脂质体法转染包装 细胞一293T细胞，获得具有感染能力的重组逆转录病毒。将含有完整Flt3重组 逆转录病毒的293T细胞上清混合WEHI细胞上清，在同一培养孔中同时感染L929 细胞和BaF细胞，而后利用L929细胞为贴壁非IL．3依赖生长和BaF细胞为悬 浮IL．3依赖生长的特点分离培养，并用不同浓度的Zeocinc加压筛选获得抗性 转基因细胞的基础上，采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析，获得稳定表达Fit3 分子的L．Fit3和BaF。Flt3转基因细胞。这一转基因策略为悬浮细胞转基因效率 低下提供了新的高效率的解决方案。 二、鼠抗人F I t3单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 1、鼠抗人FIt3单克隆抗体的研制 以BaF—Flt3细胞和L929-Flt3细胞作为免疫原，免疫Balb／e小鼠。采用B 淋巴瘤杂交瘤技术，将免疫Balb／c小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／O进行 融合，经HAT筛选，以BaF-Flt3筛选抗原，经多次亚克隆化及反复筛选，在融合 的10块96孔板中，最终得到2株持续分泌抗人Flt3单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (10A5和10G6)，快速定性试纸条分析法结果显示：1066 Ig类别为IgGl，10A5 Ig 类别为IgM。经体外长期培养和液氮冻存后，复苏的杂交瘤细胞生长良好，稳定 分泌抗体。 将杂交瘤细胞注入降植烷(Pristane)预致敏的Balb／c小鼠，诱生腹水，10G6 腹水型单抗的效价1：1000，lOA5腹水型单抗的效价为1：5000。10G6腹水经 Protein G亲和层析柱分离纯化，1066单抗的浓度为1．2mg／ml，按0．2 u g／106个 细胞进行流式分析时，仍能识别8aF—F1t3细胞。 2、鼠抗人F I t3单克隆抗体生物学特性的研究 以BaF-F1t3为竞争靶细胞，采用竞争抑制实验分析1066识别的抗原位点。 实验结果表明10G6与商品化单抗SFl．340识别完全不同的位点。 选择多个细胞株：8226、8901、ECV、XGl、XG2、U266、HL60和SHI—l，利 用单抗lOA5和1066与SFl．340单抗，经间接免疫荧光标记分析，检测结果显示： 8901、ECV、XGl和xG2细胞表面均未检测到Flt3分子表达，而8226、U266、 HL60有低水平Flt3表达，SHI—l表面则检测到Flt3高水平表达。单抗lOA5和 n Fit3及 Fit