FMRP PS1和PS2相互作蛋白的分析.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 中国协和医科大学博士论文 中国协和医科大学博士论文 中文摘要 中文摘要 学习和记忆是人脑重要的功能。本工作着重研究导致智力低下的脆性x智力低 下蛋白FMRP以及阿尔茨海默疾病相关的早老蛋白PSl和PS2的相互作用蛋白，进 一步探讨FMRP蛋白以及早老蛋白PSI和PS2的功能和可能涉及的信号传导途径， 并为疾病发病机制的研究提供新的线索。 一一一一‘ 一、FMRP与NM23 H2相互作用的研究 ， f脆性x综合症是最常见的遗传性智力低下疾病，其致病基因FMRl编码FMRP 蛋哦现已鉴定出十种与FMRP相互作用的蛋白，并发现FMRP能运载特定的 mRNAs，调控mRNAs的翻译；FMRP还参与调节树突突触后蛋白的合成和树突棘的 成熟。我们试图通过筛选人脑海马文库，进一步寻找与FMRP相互作用蛋白，研究 FMRP的功能和可能涉及的信号传导途径。 选用14外显子出核信号序列突变的全长FMRP筛选人脑海马cDNA文库f本室 梅品超博士构建)。得到一阳性克隆，测序证明它是人核昔酸二磷酸激酶亚基B (NDK／NM23 H2)。运用双向的酵母双杂交体系证实了FMRP与NM23 H2的相互作 用。利用十种FMRP异构体，进行双向酵母双杂交实验，发现NM23 H2与FMRP的 作用区域定位于FMRP外显子1．11，与第12．17外显子无关；FMRP外显子1．6和2—7 不能单独与NM23 H2相互作用。为进一步证实FMRP和NM23 H2的相互作用，通 过细胞免疫共沉淀实验在体内发现，FMRP能与NM23 H2相互共沉淀，证明了FMRP 确实能与NM23 H2相互作用，并且这种相互作用是特异的。我们正运用细胞免疫荧 光和共聚焦实验观察它们在细胞内的定位和定位区域的变化，并寻找相关的信号途 径。 NM23 H2是一种肿瘤转移抑制子，能激活c—myc的转录并参与细胞的生长分化； 还能催化合成除ATP之外的其他三种NTP，而NTP是DNA／RNA合成的底物。近来 发现NM23能结合Rad，参与Ras信号途径。FMRP可能通过结合NM23 H2来参与 Ras相关的信号途径，调节神经元的发育和树突棘的成熟。也可能通过与NM23 H2 的结合，作为胞内RNA含量变化的信号，间接地参与基因的表达调控；或通过调节 NM23 H2的NTP合成酶活性，改变RNA底物NTP的浓度，反过来调节RNA的代 孰) 中国协和医科大学博士论文 中国协和医科大学博士论文 中文摘要 二、与PSl和PS2相互作用蛋白的筛选与研究 ，阿尔茨海默疾病(AD)是一种中枢神经系统不可逆的退行性疾病，是导致老年人 失忆最普遍的疾病。其显著特征是老年斑和神经元纤维缠结，并伴以大量神经元细胞 的死亡。Psl、PS2和APP是AD相关的致病基因，已发现50多个PSl突变和2个 PS2突变与家族性AD有关。通过寻找与Ps相互作用蛋白，发现Ps参与APP的酶 切加工、调控细胞的凋亡和Notch信号途径。为进一步研究PS的功能，我们采用酵 母双杂交体系筛选与Psl和PS2相互作用蛋白，并寻找与其相关的信号途径。 采用全长Psl和PS2筛选人脑海马cDNA文库，得到一个阳性克隆，测序表明 它是Bcl．2抗凋亡蛋白。利用双向的酵母双杂交实验证明了PSl和PS2都能与Bcl．2 结合。同时，分别构建十六种PSl和PS2的异构体，进行双向酵母双杂交实验，我 们发现它们的相互作用位点定位于PSl和PS2的羧基末端约100个氨基酸。其中Bcl．2 与PSl的作用位点定位于PSl C端361．467位氨基酸，与PS2的作用位点定位于PS2 C端341—448位氨基酸，两者都位于Ps蛋白的羧基末端约100个氨基酸位置。 Bcl一2是细胞凋亡的重要调节者，在线粒体水平决定着细胞的存活。我们通过酵 母双杂交实验证明PSl和PS2都能直接结合Bcl．2。国外已经报导PSl与Bcl一2的相 互作用能促进细胞凋亡；而我们发现PS2也能与Bcl．2相互作用，两者的结合可能起 抗凋亡的作用。Psl和PS2可能通过与Bcl．2的竞争性结合来调控神经元细胞的存活； 也可能通过与Bcl．2家族中其它成员之间的竞争性结合来调控神经元细胞的凋亡。 总之，(1)．用FMRP、PSl和PS2筛选人脑海马文库，得到了FMRP的相互作 用蛋白NM23 H2以及PSlPS2的作用蛋白Bcl．2。(2)．利用双向的酵母双杂交实验 证明了FMRP和NM23 H2之间以及PSlPS2与Bcl．2之间的相互作用。(3)．通过 双向酵母双杂交实验把FMRP和NM23的作用定位于FMRP的前11个外显子；Bcl．2 与PSl的作用定位于PSl羧基末端361—467位氨基酸，Bcl一2与PS2的作用定位于PS2 羧基末端34