JASTATNFκB通路介导高糖引起的人脐静脉内皮细胞的损伤与炎症反应.docx

硕士学位论文 JAK．STAT／NF．rd3通路介导高糖引起的人脐 静脉内皮细胞的损伤与炎症反应 硕士研究生：廖静秋 指导老师：吴文教授 IIIIIIIII rll M Illll IIIII rll II IIJ Y3 1 1 691 7 摘要 研究背景 糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。近 年来，随着社会发展，经济条件改善，人民生活水平提高，糖尿病患病率逐年 上升。糖尿病血管病变(Diabetic angiopathy，DA)是糖尿病患者最常见的慢性 并发症，也是糖尿病患者失明、截肢以及死亡的主要原因之一，严重影响患者 预后和生活质量。 高血糖通过直接或间接的影响引起血管内皮功能异常，启动或加重糖尿病 血管病变。过去关于高血糖损伤血管内皮细胞的机制主要集中于糖基化终末产 物、多元醇通路、蛋白激酶C等，近年来，新的研究目光己逐渐转向内皮细胞 损伤过程中的各种细胞信号转导通路。Janus激酶／信号转导子与转录激活子 (Janus kinase signal transducer and activator of transcription，JAK／STAT)通路是 细胞信号转导的重要通路之一。新近研究发现，JAK／STAT通路参与了糖尿病并 发症的发生发展。Marrero MR等人发现，高糖在。肾小球滤过膜细胞通过激活 JAK／STAT通路导致肾小球滤过膜细胞的增殖，从而引起糖尿病肾病。此外，有 研究通过建立糖尿病大鼠模型，发现JAK／STAT信号转导通路的激活可能参与了 糖尿病心肌病心肌纤维化的发生发展。而对于JAK／STAT通路是否参与高糖诱导 血管内皮细胞的多种损伤，目前鲜有报道。 万方数据  摘 要 核因子．rd3(nuclear factor-KB，NF．r,B)信号通路对炎症反应、免疫反应等 具有重要调节作用。相关研究显示高糖可通过激活NF．1cB通路促使内皮细胞炎 症及免疫反应相关因子生成增多进而推进血管炎症的发生发展，而血管炎症正 是糖尿病血管病变发生发展过程中一个重要的阶段。已有多项证据表明 JAK／STAT信号通路与NF．r,B信号通路之间存在交互作用。Digicaylioglu M等发 现红细胞生成素(EPO)可通过NF．v,B信号通路介导神经保护作用，而这一过 程可被JAK／STAT通路调节。那么，在血管内皮细???中， JAK／STAT信号通路 可否调节NF．rd3信号通路介导高糖诱导的血管内皮细胞炎症反应还有待进一步 研究探讨。 为此，本文旨在探讨JAK／STAT通路在高糖诱导人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)损伤过程中的作用以及在这一过程中JAK／STAT通路可否调节 NF．r,B信号通路介导高糖诱导的血管内皮细胞炎症反应，为深入阐明高糖损伤 血管内皮细胞的作用机制提供新颖的实验依据。 研究方法 1人脐静脉内皮细胞的体外培养 细胞培养在含10％FBS的低糖DMEM培养基中，加入100 U青霉素、100 mg 链霉素，置于37℃、含5％C02的培养箱中培养。待细胞融合达80％后，使用 0．25％胰蛋白酶．EDTA进行消化，适度消化后加入完全培养基终止胰蛋白酶的消 化作用。将细胞吹落以形成细胞悬液。1200 r／min离心5 min，弃上清，按1：3传 代。 2实验分组 实验分为6组：(1)t常对照(contr01)组；(2)高糖(high glucose，HG) 损伤组；(3)AG490(JAK／STAT通路抑制剂)预处理+高糖损伤组；(4)AG490 组；(5)PDTC(NF．r,B通路抑制剂)预处理+高糖损伤组；(6)PDTC组。 3 CCK．8实验测定细胞存活率 将HUVECs接种在96孔培养板中，当细胞在培养孔内生长至大约80％时， II 万方数据  硕士学位论文 根据实验要求给予不同处理，于每孔加入10 txL CCK．8溶液，37℃孵育2 h， 用酶标仪检测各孔吸光值，波长设定为450 nm，并根据公式：细胞存活率(％) =处理组OD值／对照组OD值×100％，求得细胞存活率。 4 Western blot法检测JAK2、STAT3、caspase．9、eNOS和NF．r,B p65的表达 将HUVECs接种于60 mm培养皿中，细胞贴壁生长至80％时给予不同处理 因素，弃培养液，用预冷的PBS冲洗2次，各皿加入80¨l裂解液后置于4℃ 裂解30 min，12000 r／min离心15 min，取上清液，蛋白浓度采用BCA法进行测 定。总蛋白经SDS．PAGE分离后，转移到PVDF膜上。使用5％脱脂奶粉封闭 90 min后，弃封闭液，分别加入p-JAK2和JAK2(1：2000)，p-STAT3、STAT3 和ca