JEV PrMM蛋白单克隆抗体的制备及JEV P3感染U51细胞蛋白质组学分析.docx

分类号 分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 JEV PrM脚蛋白单克隆抗体的制备及JEV P3感染 U251细胞蛋白质组学分析 PREPARATION oF MoNoCLoNAL ANTIBoDIES AGAINST PRM／M PRoTEIN oF JEV AND PRoTEoMIC ANALYSIS OF U251 CELLS INFECTED WITH JEV P3 研 究 生： 缪欢 学 号： 2012302110179 指导教师： 曹胜波教授 指导小组： 曹胜波教授 宋云峰副教授 专业：预防兽医学 研究方向：动物传染病 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2015年6月 华中农业大学动物科技学院动物医学院 二。一五年六月 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 歹式 如需必威体育官网网址，解密时间 年 月 固 翻 楚否必威体育官网网址 籼陛翮 I娜嬲燮必 本人声明所呈交的论文是我个人在导炳指导下送行约研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文申特别加以标注和致谢的地方掺，论文中不包含其他人已经凌 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农监大学或其他教育枧鞫的学位或证书 两使周过豹材料，指导教9季对此遂行了审定。与我一同工作的同志对本研究所傲的任 何贡簸均已在论文中敛了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：拶义欠 时阀： 多移侈年 6月 14医 学位论文使用授权书 娥懈鹳：雳妖鞭签名凳／ 签名舅翔：20 t2年6月埤日 签名雹期：弘∥年g月压舀 万方数据 JEV JEV PrM／M蛋白单克隆抗体的制备及JEV P3感染U251细胞蛋白质组学分析 目 录 摘 要 ．i Abstract ．．． ．． ． ．．．． ． ．．．．．． ． ．． ． ． ．． ．．iii 中英文缩略语表(Abbreviation) v 第一章JEV文献综述 ．1 1．乙型脑炎的流行病学 1 1．1乙脑的流行特征 1 1．2乙脑的传播媒介与易感群体 2 2．乙型脑炎病毒的生物学特性 ．3 2．1乙型脑炎病毒的病原性 3 2．2乙型脑炎病毒的生物学特性 4 2f3乙型脑炎病毒的结构蛋白 5 2．4乙型脑炎病毒的非结构蛋白 5 2．5乙型脑炎病毒的理化特性 6 2．6乙型脑炎病毒的增殖特性 7 2．7乙型脑炎病毒的复制过程 7 3．乙型脑炎病毒的入侵和致病机理 ．8 4．乙型脑炎的临床表现 ．9 5．乙型脑炎的病理变化 9 6．乙型脑炎的诊断 一10 6．1血清学检测 ．10 6．2病毒分离培养 ．10 6．3分子生物学检测 ．10 7．乙型脑炎的防治及疫苗研究现状 11 7．1灭活疫苗 11 7．2减毒活疫苗 12 第二章JEV M蛋白单克隆抗体的制各及特性分析 13 1．前言 。13 1．1单克隆抗体的原理 13 1．2单克隆抗体的应用及发展 ．14 2．研究目的与意义 ．15 3．材料与方法 一16 3．1实验材料 1 6 3．1．1质粒、菌株、病毒、细胞和动物 ．．16 3．1．2主要试剂、仪器和耗材 。17 3．1．3抗生素及其配制方法 。1 7 3．1．4主要培养基及其配制 18 3．1．5主要缓冲液(溶液)及其配制 18 3．2实验方法与步骤 ．20 3．2．1 M蛋白引物的设计 一20 3．2．2 M蛋白基因的扩增 ～20 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文3．2．3 华中农业大学2015届硕士研究生学位(毕业)论文 3．2．3 M蛋白基因片段的纯化回收 ．20 3．2．4 PCR回收产物及表达载体的处理 ．21 3。2。5目的基因与载体的连接 。21 3．2．6连接产物的转化 ．．21 3．2．7重组质粒的提取 ．．2l 3．2．8重组质粒的鉴定 。22 3．2．9重组质粒p28a-sumo—M的诱导表达 22 3．2．10表达产物p28a-sumo．M的SDS．PAGE分析。 23 3．2．11表达产物p28a-sumo。M的Western Blot分析 23 3．2．12不溶性包涵体蛋白纯化方法 24 3．2．13动物免疫 25 3．2．14间接ELISA检测方法的建立 ．25 3．2．15间接ELISA法检测小鼠的免疫效价 ．26 3．2．16 SP2／0骨髓瘤细胞的制备 ．26 3．2．17免疫脾细胞的制备 26 3．2．18饲养细胞的制备 27 3．2．19细胞融合 27 3．2．20阳性杂交瘤细胞的筛选 28 3．2．2l阳性杂交瘤细胞的亚克隆 28 3．2．22杂交瘤细胞的染色体计数 28 3．2．23单抗腹水的制各及抗体效价的测定 29 3．2．24单克隆抗体的纯化 29 3．2．25单克隆抗体蛋白质含量的测定