JNK号通路在二甲基胂酸所致人胚肺成纤维细胞DNA损伤和凋亡中的作用.docx

南京医科大学硕士学位论文论文独创性声明 南京医科大学硕士学位论文 论文独创性声明 本论文题邀焦墨鎏整查丕里塞盟堕盟鍪冬墅韭盛堑箜塑整壁照筮塑 篓塑烫室史煎笠曼．是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已 经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所敛的贡献均在 论文中作了明确的声明并表示了谢意。 专监：一者签名：焯霹期：触础 论文使用授权声明 本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论 文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保 密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：多年导师签名：』咀数霹期：龇 鬻窳嚣科大学硕士攀彼论文斟K僖号通路在二甲基嚣枣酸所致人胚萎奉成纤维细臆 鬻窳嚣科大学硕士攀彼论文 斟K僖号通路在二甲基嚣枣酸所致人胚萎奉成纤维细臆 DNA损伤和凋亡中的作用 南京医科大学公共卫生学院，南京210029 研究生 尹仕伟 指导教师 刘起展教授 指导小组 周建伟教授 李患截教授 李爱萍助理研究员 中文摘要 砷是人类确定(I类)致癌物，通过食用含有无机砷化物的水和食物所 季|起的砷中毒在全世界广泛存在。另外一方萄，砷还是多种肿瘤有效化学 治疗药物，因此，环境和医源性接触砷化物的机会大大增加。二甲基胂酸 (DMA)是无机砷在人体肉的主要的甲基化代谢产物，其本身也广泛用作 杀虫剂。传统的观念一直认为砷在体内的甲基化过程是一个解毒促排泄过 程，但是最近有研究表明D凇可警l起细胞DNA断裂，DNA-蛋白质交联和 细胞凋亡，认为DMA具有遗传毒性和致癌性。最近越来越多的研究表碉砷 的甲基化过程可能幂仅仅是含解毒机制，砷在体内的甲基化过程可能在砷 致癌过程审发挥重要作用。罄前关于砷甲基化代谢产物在体外毒褴机制的 研究较少，DMA损．伤细胞的机制还不太清楚，其中关于信号通路在其中的 2 鬻索医零萼大学硕士攀僚论文作用的研究比较少。c-Jurt氨基朱端激酶(JNK)信号通路是丝裂原激活 鬻索医零萼大学硕士攀僚论文 作用的研究比较少。c-Jurt氨基朱端激酶(JNK)信号通路是丝裂原激活 蛋白激酶(MAPK》家族信号通路的重要囊通路之一，，其参与调控细胞增 殖、分化与凋亡。有研究发现孙派信号通路在无机砷及其他合物鼹致细胞 损伤中发挥一定作用。霾诧，阐明DMA所致细胞损伤及英分子机制对于探 讨砷致癌分子机制及砷中毒的防治具有重要意义。 本课题拟探讨不溺浓度D淞对人胚肺成纤维细胞(HELF)N殖、DNA 损伤、细胞周期和凋亡及nⅨ信号通路的影响；并应用扑K抑制荆和反义 抑制技术构建扑Ⅸ缺陷HELF．细胞，以阻断心x信号通路来深入探讨羚淤信 号通路在DMA所致胍LF细胞DNA损伤和凋亡中的作用，为进一步揭示 DMA所致细胞损伤的分子机制，全面了解砷的致癌分子机制和砷化物对机 体的影响提供一定的科学依据。 方法 一、DMA对HELF细胞增殖的影响 用0．0、2．5、5．0、10。0、20．0 grnol／L DMA分别处理HELF细胞12、 24、48 h，用MTT法和CCK．8法检测HELF细胞相对增殖率，寻找其所 致HELF细胞增殖蜷剂量。效应和时间．效应关系。 二、DMA对HELF细胞DNA损伤的影响 用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0 gmol／L DMA分别处理HELF细胞12、 24、48 h，收集HELF细胞蛋白，用Western blot检测HELF细胞 v．H2AX蛋白表达水平，并用鼠一张膜上相应泳道的[3-actin条带的灰度 进行校正。 篱京医秘大学硕士学位论文三、DMA对HELF细胞周期的影响 篱京医秘大学硕士学位论文 三、DMA对HELF细胞周期的影响 用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0狮aaol／L DMA分别处理I／ELF细胞48 h 或用20．0 tamol几DMA分别处理HELF细胞12、24、48 h，收集细胞，用 流式细胞仪检测细胞周期的变化。 四、DMA对HELF细胞凋亡的影响 周0．0、2．5、5．0、10．0、20．0 pmol／L DMA分别处理HELF细胞12、 24、48 h，分别用Hoechst 33258法检测HELF细胞凋亡形态学变化及细胞 凋亡率和用Western blot检测HELF细胞断裂Caspase 3蛋白表达水平，寻 找其剂量．效应乖时间一效应关系。 五、DMA对HELF细胞磷酸化J-NK表达水平的影响 用0．0、2．5、5．0、10．0、20．0}tmol／L DMA分别处理HELF细胞12、 24、48 h，收集HELF细胞蛋白，用Western blot检测HELF细胞