Fucoxanthin治疗胶质母细胞瘤其分子机制的研究-外科学专业毕业论文.docx

硕士学位论文用Hoechst 硕士学位论文 用Hoechst 33342染色各组细胞，于荧光显微镜下拍摄照片。 设置不同浓度的Fucoxanthin(OpM、259M、50 1．tM)处理细胞24小时，采 用DIOC6(3)染色各组细胞，流式细胞仪检测线粒体膜电位变化。 设置不同浓度的Fucoxanthin(09M、2511M、50 gM)处理细胞24小时，采 用Annexin V-FITC／SYTOx Green双染各组细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。 设置不同浓度的Fucoxanthin(OpM、50 gM)处理细胞24小时，收集并处 理细胞后，使用透射电子显微镜观察细胞亚显微结构。 3．检测Fucoxanthin在诱导凋亡过程中凋亡相关蛋白的表达 设置不同浓度的Fucoxanthin(0rtM、25ttM、50 l-tM)处理细胞24小时后 Western blotting检测H2AX、Bcl一2、PARP、BAX、caspase-9、caspase-3的蛋白 水平变化。 4． P13K／Al(t／mTOR及下游相关蛋白在Fucoxanthin诱导凋亡过程中的作用机制 设置不同浓度的Fucoxanthin(OpM、259M、50“M)处理细胞24小时后 Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p—mTOR的蛋白水平变化。 进一步验证Fucoxanthin通过P13K／A kt／，mTOR信号通路诱导细胞凋亡，设置 Fucoxanthin(OpM、50 gM)组并加入P13K抑制剂LY294002处理细胞24小时 后Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl一2、BAX、 Cleaved．capase．9的蛋白水平变化。 5．细胞划痕实验检测细胞迁移 将U87细胞接种于6孔板中，24小时后使用200微升枪头整齐划出划痕， 更换无血清培养基后加入不同浓度Fucoxanthin(OlxM、25山vl、50 oM)处理细 胞18小时后，镜下观察瘢痕修复情况并拍照，瘢痕修复率=(初始痕宽一处理后痕 宽)／初始痕宽。 6．Transwell检测细胞迁徙 使用含l％FBS培养基重悬U87细胞接种于上小室，20％FBS培养基置于下 室，不同浓度的Fucoxanthin(0rtM、25rtM、50 1．tM)处理细胞24小时后，0．1％ 结晶紫染色后镜下观察并拍照，33％醋酸溶解结晶紫后测量各组570 nmOD值。 III 万方数据 摘要7．Transwell检测细胞侵袭 摘要 7．Transwell检测细胞侵袭 将U87细胞接种于预先铺设基质胶的上小室内，使用含l％FBS培养基重悬 U87细胞接种于上小室，20％FBS培养基置于下室，不同浓度Fucoxanthin(09M、 259M、50州)处理细胞24小时后，O．1％结晶紫染色后镜下观察并拍照，33％ 醋酸溶解结晶紫后测量各组570 nmOD值。 8．在Fucoxanthin的作用下影响胶质母细胞侵袭迁移相关蛋白的变化 将不同浓度的Fucoxanthin(OgM、250M、50 lxM)处理U87细胞24小时后， Western blotting检测MMP一9、MMP．2、uPA的表达水平的变化。 9．检测MMPs上游MAPK途径相关蛋白的表达水平的影响 将不同浓度的Fucoxanthin(O斗M、259M、50 gM)处理U87细胞24小时后， Western blotting检测p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平的 变化。 Fucoxanthin(0州、50 rtM)并加入p38抑制剂SB203580，处理细胞24小时 后Western blotting检测p38、p-p38、MMP一9、MMP一2的蛋白水平变化。 10．裸鼠皮下成瘤实验检测Fucoxanthin抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡 U87细胞(5xlO)被注射在5周裸鼠腋下，注射后次日将Fucoxanthin(0、 1 g／kg)溶解于豆油寄予口服给药，每隔7天测量一次肿瘤体积，给药28天后 将瘤组织取出并测量肿瘤重量。瘤组织切片HE、TUNEL染色后镜下观察并拍 照。提取瘤组织蛋白，Western blotting检测Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Bcl一2、 BAX、Cleaved—capase一9、p38、p-p38、MMP一9、MMP一2蛋白表达水平变化。 11．统计学分析 所有数据用均数4-标准差(x 4-S)表示，使用Sigrnastat3．5统计学软件，多组 间比较采用单因素方差分析，Turkey检验，P0．05认为有显著差异。 研究结