F蛋白诱导大鼠移植免疫耐受的初步分析.docx

天津医科人学硕+学位论文 中文摘要 随着肝移植技术的不断进步和完善，使得越来越多的终术期肝病患者的生 存期得到了很大程度的延长。但急性排斥反应(Acute Rejection，AR)仍然是肝移 植术后最严重的并发症之一，其发生率仍然高达40％．60％，因此免疫耐受仍然 是肝移植研究的重点之一。免疫耐受的机制有很多学说，各种高效免疫抑制剂 也在不断推出，但是近年来越来越多的关注肝脏特异性蛋白(F蛋白)诱导肝移 植术后免疫耐受的研究，使我们对肝移植免疫耐受的发生、发展有了更进一步 的理解。 F蛋白的表达及纯化 本文在前人研究的基础上，将F蛋白原核表达载体pET-15b转化的大肠杆菌表 达菌BL21(DE3)pLysS，用IPTG诱导其表达，表达后通过亲和层析柱 (Ni2+一—ch榷ed IDA Hi卜-blnd column)纯化，用十二烷基硫酸钠一聚丙稀酞胺凝 胶电泳与免疫印迹(Western blot)对其进行检测。人F蛋白的表达菌株 BL21(DE3)pLysS表???后的全菌蛋白进行SDs_冲AGE电泳检测，目的条带分子量 大小约为43kD，与文献报导一致。westernJblot显示纯化后的F蛋白与豚鼠抗人 提纯F蛋白多克隆抗血清反应为阳性，说明我们经基因工程方法得到的纯化的F ‘ 蛋白具有免疫活性。 F蛋白诱导大鼠肝移植免疫耐受的初步研究 为了观察两种不同品系即近交系Wistar和封闭群SD大鼠原位肝移植术后的 急性排斥反应及F蛋白诱导肝移植免疫耐受的情况。我们将健康雄性清洁的近交 系Wistar和封闭群SD大鼠随机分为3组，A：同基因对照组：SD--}SD；B：急性排斥 组：Wistar，SD；C：F蛋白干预组：术前一周胸腺内注射0．4mg。采用Kamada一--袖 套法，建立上述Wistar和SD组合之间的肝移植模型。A、B和C组受体分别于术后 3d、6d、9d及lOOd，四个时间点各杀死三只大鼠，收集肝组织和血清分别做相 应检测，另留取部分新鲜肝组织立即置入液氮中保存备用。剩余的大鼠用于观 察肝移植术后长期生存率。实验过程中共完成108例次大鼠原位肝移植(rat orthotopic liver transplantation，ROLT)操作，总的手术成功率为62．96％(68／108)， 其中模型训练的前期完成45例，24h成活率仅24．44％(1 1／45)以后随着手术技巧成 熟，手术成功率逐渐达到90％以上。大鼠肝移植手术死亡的主要原因为出血、麻 醉意外、无肝期太长、血栓形成等。A组同基因对照组，术后组织学检查无排  天津医科人学硕十学位论文 斤反应表现。B组急性排斥组自术后3d开始，出现I级排斥反应，6d以后逐渐达 到高峰，大多数死于术后12～21d。C组F蛋白干预组办未见确切排斥反应证据。结 果表明：(1)二袖套法操作简便，手术成功率高，可作为肝移植实验的有效手段。 (2)成功建立大鼠原位肝移植模型的关键在于完善的手术技术，主要包括高质量 的供肝获取、熟练的显微血管吻合技术和尽量短的无肝期。(3)近交系Wistar和 封闭群SD大鼠之间建立的原位肝移植模型，能满足急性排斥反应或免疫耐受实 验研究的需要。(4)F蛋白可以诱导大鼠肝移植免疫耐受。 关键词： F蛋白基因工程大鼠原位肝移植二袖套法免疫耐受 II  Abstract With the contlnuous progress of liver transplantation and impr0Ve，m撕ng more 觚d more the survival of patients with end-stage liver disease haS beell a Iarge degree of extenslom However,acute rejection(Acute Rejection，AR)atier liver 咖Spl锄t撕on胁ains the most serious complication，its incidence r觚ains hi曲at 40％-60％,so immune tolerance is still the focus of the study of 1iVef‰splalltation． 1 nere are m柏y mechanisms of immune tolerance theory,a v撕ety of e髓ctive 1nlmunosuppresSive agents are constantly introduced，but more and more attention in recellt years，me liver specific protein(F protein)indu