Lin28BLeT7调控环影响胃癌进的实验研究.docx

解放军医学院博士学位论文作 解放军医学院博士学位论文 作 者： 张勇 学科专业：外科学(普外) 导 师：陈凛教授 Lin28B／Let．7调控环影响胃癌进展的实验研究 中文摘要 背景 目前；临床所见消化道恶性肿瘤中，胃癌是发病率最高的，同时胃癌死亡率 住居全球第三位。胃癌在我国发病率位居前列，近年胃癌死亡率依然位于前五位。 随着外科技术、化疗方式、放疗以及分子靶向治疗的进展，近年来胃癌预后得到 了改善。但胃癌的长期预后仍然不佳，进展期胃癌的5年生存率低于40％。 Lin28B蛋白是“n28的同源物，是最初发现于线虫中的一个高度保守的小RNA 结合蛋白。Lin28B结构包括一对能够结合RNA的独特的RNA联结模体一冷休克结构 域和一对反向的CCHC锌指结构域。研究发现Lin28是在胚胎和胚胎干细胞高表达。 正常成人组织中低表达，这表明Lin28可能在胚胎发育过程中的对细胞增殖和分化 起关键作用。Lin28B促进恶变，其表达与多种类型的肿瘤，包括肝癌，肾母细胞 瘤，卵巢癌和生殖细胞肿瘤的晚期阶段相关。它在各种肿瘤如肝细胞癌和结肠直 肠癌高表达。Lill28的过度袁达已被证明促进肿瘤细胞增殖。Lin28高表达是肝癌 预后不良因素，Lill28B显著与结直肠癌淋巴结转移有关。 小分子(microRNA，miRNA)是一种小分子非编码1wA，约22个核苷酸长， 其通过反义机制抑制靶信使核糖核酸。近来越来越多的证据表明，miRNA作为肿 瘤抑制或致癌者参与肿瘤的发生和发展。miRNALet．7最初在线虫中被发现，作为 异时性基因促进线虫幼虫期到成虫的过渡。对Let．7的进一步研究表明其在细胞增 殖，分化，凋亡，代谢均有功能。研究表明Let一7的水平在人肿瘤中降低，而且其 缺失或下调能够与肿瘤侵袭性和临床预后差相光。另外有体内研究表明Let．7的异 常表达能够减少化疗抵抗和癌细胞侵袭，抑制人肺癌生长。 在分子水平上，Lin28是Let．7生物合成的抑制荆。LiTl28B通过作用于Let．7的成 熟的过程和细胞分化来调节Let．7家族的成员。已有研究报道Lin28作为调节器可结 合Let一7的前体miRNA阻止胚胎干细胞的成熟。Let一7的这种特殊的功能在从人成纤 万方数据 解放车医学院博{：学位论文维细胞形成诱导多能干细胞(induced 解放车医学院博{：学位论文 维细胞形成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)的过程中可 提高细胞的形成效率。一些研究也已经表明Lin28和Let一7之间的关联作用，特别是 细胞分化和增殖的过程中。 然而既往对胃癌的研究中，Lin28B／Let一7调控环在胃癌中是否存在并没有确切 研究结果，同时Lin28B／Let一7调控环对于胃癌具体进展的影响也无明确的结论。本 研究的目的是通过以下实验，明确Lin28B／Let．7调控环在胃癌中存在，并进一步通 过体内和体外研究探索其对胃癌发展的影响。 目的 1．分别在胃癌细胞系和胃癌组织中，检测Lin28B以及Let一7的表达，分析 其是否存在相关性：2．明确Lin28B／Let．7调控环在胃癌细胞中的存在；3．在胃癌 细胞中过表达Let．7，观察其对胃癌细胞增殖和细胞周期的影响：4．观察胃癌细胞 内过表达Let．7对化疗药物5．氟尿嘧啶敏感性的变化；5．观察过表达Let一7对裸鼠人 胃癌皮下移植瘤生长的影响。 方法 1．通过IUPCR和Westem Blot方法检测胃癌肿瘤组织样本及正常对照组织 中“1128B表达水平的差异；通过qRT-PCR方法检测胃癌肿瘤组织样本及正常对照组 织中Let-7表达水平的差异：通过利用流式细胞仪(now c”ome仃y，FCM)分选 胃癌细胞系BGC．823中CDl33+／CD44+的细胞，检测其中Lill28B和Let一7表达水平。 2．采用慢病毒转染方法，将Let一7转染入BGC一823细胞中，然后检测Lin28B袁达水 平。 3．采用CCK一8法检测过表达Let．7对BGC一823细胞增殖的影响。 4．采用CCK一8法检测BGC一823细胞和转染Let．7后BGC．823细胞对5．氟尿嘧啶的药 物敏感性。 5．细胞成球实验评价Let一7对BGC一823细胞分化能力的影响。 6．裸鼠成瘤实验评价过表达Let．7对BGC．823细胞体内成瘤能力的影响。 结果 1．Lill28B和Let．7在胃癌组织和癌旁正常组织中均存在；Let．7在胃癌肿瘤组织中表 达水平较癌旁正常组织显著降低，差异有统计学意义(P0．05)：Lin28B在胃癌肿瘤 组织中表达水平较癌旁正常组织显著增高，差异有统计学意义(PO．05)。 2．在的胃癌细胞系BGC一823发现Lin28B和Let．7均有