GMFβMKK36信号通路在β榄香烯抗脑胶质瘤细胞殖中的作用.docx

大连医科大学 博士学位论文 GMFβ-MKK3/6信号通路在β-榄香烯抗脑胶质瘤细胞增殖中的作 用 姓名：朱廷准 申请学位级别：博士 专业：神经外科学 指导教师：徐英辉 201106 GMFl3．MKK3／6信号通路在p-榄香烯抗脑胶质瘤 GMFl3．MKK3／6信号通路在p-榄香烯抗脑胶质瘤 细胞增殖中的作用 博士研究生： 朱廷准 指导教师： 徐英辉教授 指导小组： 刘荣耀教授 廉治刚教授 张健教授 专业名称： 神经外科学 摘要 榄香烯(Elemene)是我国自主开发的、从中药莪术(温郁金)中提取的国家 二类非细胞毒性抗肿瘤药，以p．、丫．和6．榄香烯的油状混合物形式存在。作为其主 要的活性成分，B．榄香烯在体内和体外可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖。但由于抗 胶质瘤作用的分子机制尚不明确，限制了其在临床上的应用。丝裂原活化蛋白激 酶激酶-3(Mitogen-activated protein l【inase kinase 3，MKK3)和-6(Mitogen-activated protein kinase kinase 6，MKK6)是丝裂原活化蛋白激酶p38(Mitogen-activated protein kinase p38，p38 MAPK)信号通路的两个上游激活因子。MKK3／6在多种肿 瘤组织中被发现表达异常，同时MKK3／6也介导了许多药物的抗肿瘤作用。神经 胶质成熟因子p(Glia Maturation Factor Beta，GM邛)是一种17 kDa的小分子脑 蛋白，在神经胶质细胞和神经元的生长发育、增殖、分化和凋亡过程中起着关键 性的调节作用，这种作用常常通过调节MAPK信号通路的活性得以实现。我们前 期的研究结果表明，p38 MAPK的激活以及细胞外信号调节蛋白激酶1／2 (Extracellular Signal．regulated Protein Kinasel／2，ERKl／2)的失活在B．榄香烯抗胶 质瘤细胞增殖中是不可或缺的。然而，p．榄香烯通过什么途径引起了胶质瘤细胞中 上述信号通路的活性改变仍不得而知。 目的： l、评价p．榄香烯对人U87及大鼠C6胶质瘤细胞的抗增殖及细胞周期阻滞作 用。 2、探讨MKK3和MKK6在p．榄香烯抗胶质瘤细胞增殖中的作用。 3、明确GM耶在B一榄香烯抗胶质瘤细胞增殖中的作用，及其与MKK3／6的 关系。 4、检测B．榄香烯对顺铂抗胶质瘤是否具有化疗增敏作用。 方法： 1、第一部分实验：分别以不同浓度(0、20、40、60和80 1、第一部分实验：分别以不同浓度(0、20、40、60和80 Itg／m1)的p一榄香烯 作用于U87及C6细胞不同的时间(0、12、24、36和48d,时)，噻唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期，并计算各 组细胞周期中00／(31期的百分比。 2、第二部分实验：用B．榄香烯处理胶质瘤细胞后，提取各组细胞的总蛋白， 用Western blot检测MKK3和MKK6的总蛋白及磷酸化蛋白含量，RT-PCR检测 MKK3和MKK6的mRNA表达水平，应用Gel．Pro Analyzer 4．0软件半定量分析条带 灰度，对结果进行统计学分析。用脂质体法将MKK3和MKK6的显性负突变 (Dominant Negative，DN)质粒DN-MKK3和DN-MKK6转染进入胶质瘤细胞中， 以抑制M网G和MKK6的活性，免疫荧光法检测转染效率，同时行MTT法检测D． 榄香烯对胶质瘤细胞活性的抑制能力。免疫组织化学方法检测人正常脑组织及胶 质瘤组织中总的及磷酸化的MKK3／6的表达水平，探索MKK3／6与胶质瘤发病的关 系。 3、第三部分实验：免疫沉淀联合Western blot法检测经p．榄香烯处理的胶质瘤 细胞中总的及磷酸化的GMFl3蛋白的表达水平。采用RNA干扰技术，使胶质瘤细胞 qbOMFJ3的表达沉默，然后以MTT法检测p．榄香烯的抗胶质瘤增殖的能力。同时， 用Western blot法检测B．榄香烯对MKK3和MKK6的激活作用是否因GM邛沉默而受 到影响。 4、第四部分实验：用化疗药顺铂和p．榄香烯单独或联合作用于胶质瘤细胞， 细胞计数法检测细胞数量，计算细胞生长抑制率，进而确定B．榄香烯对胶质瘤细胞 的化疗增敏作用。 结果： l、第一部分实验：B．榄香烯显著抑制了人U87及大鼠C6胶质瘤细胞系的增 殖活性，并增加了细胞周期中G0／G1期细胞的比例。p．榄香烯对胶质瘤细胞的增 殖抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。 2、第二部分实验：B．榄香烯使胶质瘤细胞中MKK3和MKK6的磷酸化水平 上调。相反，通过转染显性负突变质