miR136 miR3b调控静脉平滑肌细胞增殖 迁移的作用与机制研究.docx

硕士学位论文 miR一1 3 6、miR一23b调控静脉平滑肌细胞增 殖、迁移的作用与机制研究 硕士研究生：杨立国 指导教师：乔增勇 摘要 研究背景和目的 随着人们生活方式的改变及不良生活习惯的增加，冠心病的发病率在全世 界范围内逐年增加，对』一大人民群众的身体健康构成严重威胁。目前冠心病的治 疗方法除药物外，还包括经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention，PCI)、冠状动脉旁路移植术(coronaryarterybypass grafting，CABG) 等，但部分患者术后出现的新生内膜增生(neointimal hyperplasia，NIH)导致血 管再狭窄的发生，限制了上述治疗手段的远期疗效。研究发现，血管平滑肌细胞 (Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的异常增殖及迁移在NIH发生过程中发 挥重要作用。因此，抑制VSMCs异常增殖及迁移作用，可能成为减轻NIH发展 的一种潜在治疗措施。 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性单链非编码RNA(约18．22 核苷酸)，主要通过与信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3’非翻译区 (3’untranslated region，3’UTR)选择性地结合引起mRNA降解或抑制翻译，发 挥转录后调节作用。作为调节基因，miRNA不仅广泛参与到如增殖、分化、凋 亡等正常生理过程中，还在许多病理过程如各种类型肿瘤、心血管疾病、神经系 统疾病的发生及发展过程中发挥重要作用。近来，miRNA参与调控VSMCs增 殖、迁移及NIH的研究日益增多。研究发现，在球囊损伤动物模型中miR一146a、 万方数据  摘要 miR．3 1、miR．424／322等可直接促进VSMCs增殖，而miR．1、miR．1 33、miR．365 等具有抑制VSMCs增殖的作用，并可影响NIH的形成。以上研究结果均表明， miRNA在血管损伤病变中异常表达，参与调控VSMCs的功能变化，影响NIH 的形成。但目前miRNA对VSMCs的调控研究多局限于动脉，关于静脉的研究 文献报道较少，而miRNA的一个特性即具有组织及细胞特异性，因此，我们据 此相信，miRNA亦可参与调控静脉SMCs异常功能变化。 既往文献报道，miR．1 36、miR．23b均参与调控细胞生物学功能。例如，miR． 136在胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤及冠???动脉粥样斑块中异常表 达，调控细胞增殖、迁移与凋亡。miR．23b属于miR．23~27~24家族，是位于人 染色体9上的高度保守序列。研究显示：miR．23b在各种类型肿瘤，如结肠癌、 前列腺癌、乳腺癌、肾透明细胞癌及内皮细胞中异常表达，参与调控细胞增殖、 迁移及凋亡。miR．136、miR一23b是否调控静脉SMCs异常功能变化，目前未见 相关文献报道，而miR一136、miR．23b在调控静脉SMCs功能变化扮演着何种角 色及其分子机制如何，值得我们深入探讨。 本研究以大鼠移植静脉动物模型和体外培养的静脉SMCs为研究对象，目 的为明确miR．136、miR．23b在移植静脉与静脉SMCs的表达特性，进而探讨 miR．1 36、miR．23b对静脉SMCs增殖与迁移生物学特性的影响，并进一步研究 miR．23b介导SMCs生物学功能的分子机制，为深入理解CABG术后移植静脉 NIH发展的分子机制和寻找新的分子治疗靶点奠定理论基础。 方法 1．miR一136和miR．23b在移植静脉和静脉SMCs的表达分析 构建大鼠自体静脉移植模型，即颈外静脉移植到同侧颈总动脉，术后1周、 2周、4周取材，并取对侧未移植静脉为对照组，荧光定量PCR检测miR一136和 miR一23b表达水平。体外培养静脉SMCs，用血清(10％FBS)或PDGF．BB(20ng／mL) 诱导不同时间点后荧光定量PCR检测miR一136和miR．23b表达水平。 万方数据  硕士学位论文 2．miR一136和miR．23b在静脉SMCs中的生物学功能 1)采用瞬时转染方法，利用siRNA．MateTM将不同浓度miR．136和miR．23b 模拟物(mimic)转染静脉SMCs以过表达miR．136和miR．23b，同时转染无意 义序列作为阴性对照(Negative control，NC)，实验分为NC组、NC+血清组、 模拟物+血清组，转染48小时荧光定量PCR检测转染效率，确定合适转染浓度。 2)过表达miR．136和miR．23b对静脉SMCs增殖的影响：实验分为NC组、 NC+血清组、模拟物+血清组，转染48小时利用CCK．8实验和EDU实验检测细 胞增殖。