miR2在人骨髓间质干细胞成骨分化中的作用机制研究.docx

天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 背景和目的：miRNA(microRNA)是一些长度很短的非编码RNA，通过降低靶基 因的稳定性或抑制其翻译水平来影响细胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表 明miRNA对于成骨起到重要作用。关于其在成骨发生发展中所起的作用，已经 日益成为研究的热点。前期课题已经检测DISH患者黄韧带中miR．24表达较正 常人黄韧带水平下降，并预测其靶基因为Tcf-1。本课题研究miR一24在BMP一2 诱导下人骨髓基质细胞(hMSCs)向成骨细胞分化中的作用，验证其靶基因Tcgl， 阐明miR．24促进人骨髓间充质干细胞骨化机制。 方法：体外分离人骨髓间充质细胞，在体外扩增传代培养，观察其形态特点， 流式细胞仪检测培养第六代的、已纯化的骨髓间充质干细胞。BMP．2诱导hMSCs 成骨分化，No,hem blot技术检测miRNA．24在此过程中的表达模式。设置 BMP．2(+)与BMP．2(．)对照组，miR．24、anti．miR．24与miR．NC分别脂质体转染 人骨髓基质细胞(hMSCs)。ALP活性检测试剂盒检测ALP活性，加入经典成 骨诱导液后用茜素红染色检测钙结节。Western blot检测不同时间Tcf-1蛋白和 Runx2蛋白变化，实时定量PCR检测Tcf-lmRNA表达的变化。构建野生型、突 变型、缺失型Tcf-1荧光素酶报告基因载体，分别与miR．24或miR．NC共同转 染hMSCs，采用双荧光素酶报告基因检测法验证miR．24对靶基因Tcf-1的直接 调控作用。 结果：经过分离、培养的人骨髓间充质干细胞，经多次传代后，细胞逐渐纯化， 并且细胞初期多以集落形式增长，第6代后细胞曾形态均一的纺锤形，分布均 匀。流式细胞仪检测符合人骨髓间充质干细胞的特征。随着BMP-2诱导分化时 间的延长，miR．24表达逐渐降低。在BMP．2诱导下，ALP活性增加，转染miR．24 过表达降低ALP活性。转染miR．24后基质钙结节减少。RT-PCR显示转染miR．24 后Tcf-1 mRNA无明显改变。Western印迹显示转染miR．24后Tcf-1蛋白及Runx2 蛋白表达下降。miR．24与野生型、突变型荧光素酶报告基因载体共转染后荧光 素酶活性显著下降(pO．05)，而转染突变型及缺失型荧光素酶活性则无明显变 化。 结论：1．分离、培养的细胞形态正常，符合人骨髓间充质干细胞的特征。2．在 BMP．2诱导下，人骨髓间充质干细???向成骨细胞分化，miR．24随着诱导时间的  天津医科大学硕士学位论文 延长逐渐下降。3．在BMP．2诱导下，转染miR．24后，Tcf-1蛋白与Runx2蛋白 水平下降，Tcf-1mRNA未见明显改变，miR．24在翻译水平调控R01表达。，转染 miR．24后抑制ALP活性及基质钙化。4．成功构建了野生型、突变型、缺失型 Tcfol荧光素酶报告基因载体，经荧光素酶报告基因检测证实Tcf-1为miR．24作 用的靶基因。 关键词：人骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白．2 miR-24转染转录因子-1  Abstract ONective：miRNA(microRNA)are very short length of non_coding RNA，by reducing the stability of target genes or inhibit its translation level to 1nfluence cell di位rentiation，proliferation，and apoptosis．MiRNAs have been shown to offer great potential in the ossification process．We seek to investigate the role of miR-24 m m V1tm肌d osteogenic differentiation of human stromal(mesenchymal)stem cells elucidate the medlanism of miR．24 promating osteogenic differentiation· Methods：The h啪an BMSCs were collected from bone marrow and incubated in vi怕for pdmary culture and passage culture．Detect the purified MSCs with slxthed addltlon generation by Flow cytomety．Osteogenic differe