GST抗体包免疫磁珠纳米佐剂的初步分析.docx

GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究摘 GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究 摘 要 免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMB)是表面包被有抗体(或配体)的磁性微 球。能特异性吸附抗原(受体)等物质，己广泛应用于生物和医学等领域。本研究 利用化学共沉淀法合成磁珠，再将抗GST标签蛋白的抗体偶联到改性后的磁珠表面， 从而制得表面包被GST抗体的1MB，即IMB—GSTAb，然后用IMB．GSTAb捕获 GST-HAl(禽流感病毒HAl抗原)融合蛋白，最后用捕获GST-HAl的IMB免疫实 验动物鸡，探索IMB．GSTAb的生物安全性和免疫增强作用。动物实验证明IMB具 有一定的免疫增强作用和良好的生物安全性。本研究为寻找一种操作简便、安全有 效且价格低廉的新型免疫佐剂提供了参考，同时也为提高禽流感疫苗的免疫效价提 供了新的思路。 1．抗GST标签蛋白抗体的制备 培养含GST表达载体(pGEX．KG)的大肠杆菌BL21，收获GST蛋白。将经 Sepharose4B柱子纯化得到的GST蛋白免疫2周龄艾维因鸡，制备鸡抗GST多克隆 抗体。ELISA检测血清效价达1．28x104，Western blot结果表明制备的抗体具有生物 学活性。采用饱和硫酸铵粗提和葡聚糖凝胶(Sephadex G一200)过柱相结合的方法 纯化抗体，得到了纯度较高的抗体IgG，结果显示本研究制备的鸡抗GST多抗与 GST-NSl融合蛋白、GST-NP融合蛋白和GST-HAl融合蛋白均具有良好的反应性。 2．IMB．GSTAb的制备 采用化学共沉淀法合成Fe304纳米粒子，并对其表面进行修饰，使其表面带有 -NH2基团和．CHO基团，得到平均粒径在30．200 hid之间并具有超顺磁性的磁珠， 修饰前后磁珠的浓度分别为15．62 mg／mL和5．40 mg／mL。 将磁珠与GST抗体偶联制备IMB—GSTAb，用IMB．GSTAb捕获GST与禽流感 病毒HAl的融合蛋白GST-HAl。通过控制和改变缓冲介质、溶液pH值、反应时 间和温度等参数，优化磁珠偶联抗体的条件。用紫外分光光度计测定、SDS．PAGE 分析和IMB．ELISA检测等方法对磁珠偶联抗体的效果进行评价，从而获得抗体最佳 偶联条件为0．01M PB(pH7．4)缓冲液，37℃振荡孵育6 h；IMB的最佳封闭条件为 3％脱脂奶粉，37℃封闭l h；IMB．GSTAb捕获GST-HAl的最佳反应条件为37℃， 2 h；-NH2末端IMB最大捕获量为297．2A：l 1．7．g／mL，一CHO末端IMB最大捕获量 为299．1-4-6．9¨rgmL。 3．IMB佐剂效应检测 用捕获GST-HAl的IMB免疫2周龄鸡(A组)，同时设四个对照组，分别为 IMB．GSTAb组(B)、GST-HAl抗原组(C)、禽流感灭活苗(Re．5株)组(D)和PBS 组(E)，每组5只，分别于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翅下静脉采血， 华中农业大学201 华中农业大学201 1届硕士学位论文 用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验测定血清抗体效价，结果显示，首免后实验组 和D组抗体效价上升较快，到第3周时实验组与B、C和E组均存在显著差异 (P0．01)，三周后实验组抗体效价降低，表明IMB—GSTAb具有一定的免疫增强作 用，能较快的诱导机体产生相应抗体。用不同剂量IMB．GSTAb皮下注射鸡只进行 安全性试验，结果显示，当注射磁珠量达108 mg／只时，实验鸡生长未出现异常，剖 检观察未发现病理学变化，证明IMB—GSTAb具有良好的生物安全性。 关键词：免疫磁珠IMB；GST标签蛋白；佐剂；AIV-HAl Ⅱ GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究Abstract GST抗体包被免疫磁珠纳米佐剂的初步研究 Abstract Immunomagnetic Beads(IMB)were magnetic microspheres coated with antibody or ligand which could absorb antigen or receptor specifically．IMB has been widely used in biological and medical field．In this study,magnetic beads were prepared by the chemical co-precipIitation method．Then the beads were coated with GST antibody．So we got IMB—GSTAb beads which were able to c