miR6X轴调控乳腺癌Hercetin耐药的研究.docx

目 目 录 一、摘要 1 (一)中文摘要 。1 (二)英文摘要 ．．5 二、 正文 9 (一)前言 ．9 (二)材料和方法 ．．11 1．材料 ．1 1 2．方法 ．1 3 (三)结果 22 1．筛选Herceptin耐药相关microRNA ．22 2．寻找miR-6X上游影响转录因子 23 3．miR-6X下游调控因子以及影响Herceptin耐药的具体分子 机制 ．26 4．miR-6X影响Herceptin耐药的临床意义 。33 (四)讨论 36 (五)结论 38 (六)参考文献 ．．49 三、综述 ．44 (一)综述 45 (二)参考文献 ．．49 四、攻读学位期间发表文章情况 50 万方数据 五、致：谢 五、致：谢 ．5 1 万方数据 大连医科大学硕士学位论文miR-6X轴调控乳腺癌Herceptin耐药的研究 大连医科大学硕士学位论文 miR-6X轴调控乳腺癌Herceptin耐药的研究 作者姓名： 郭靖 指导教师： 叶棋浓教授 学科专业： 生物化学与分子生物学 摘要 研究背景：乳腺癌，大多诊断为恶性，虽然随着生活节奏和饮食规律的改变， 近年来在男性中也不断出现确诊病例，但乳腺癌在女性中更为常见。让人头疼的是 乳腺癌在不断“进化”后拥有着越来越高的发病率，更加不幸的是在年轻女性中 不断有确诊病例的出现。赫赛汀(Herceptin)是一种人源化的可用于临床的注射用 单克隆抗体，是一线治疗乳腺癌的药物，主要用于HER2(Human Epidermal Growth FactorReceptor2)过度表达的患者。Herceptin能够干扰HER2下游信号通路并最 终抑制乳腺肿瘤的增长。但Herceptin的有效性受HER2表达情况的限制，而且病 人耐药现象多有出现，多数发生在原本治疗有效的一年到两年内。目前针对 Herceptin作用机制的研究已经相对成熟，而对其耐药机制的研究较少，因此深入 研究其耐药机制就显得尤为重要，以便准确定位Herceptin治疗的群体，大大提升 Herceptin治疗的有效性，最终达到减小Herceptin耐药在临床治疗中的阻力。 目的：探究miR．6X(microRNA．6X)调控Herceptin治疗敏感性的作用及其机 制，为更好地实施乳腺癌抗HER2治疗，减少及避免耐药提供重要的理论依据和 潜在的分子靶标。 方法：首先，利用Herceptin耐药细胞株做mi croRNA芯片检测，筛选耐药相 关的microRNA，找到表达下调明显且目前没有报道的miR．6X。接着，利用基因 截短突变体和细胞荧光素酶活性实验找到受Herceptin调控的miR．6X启动子区域， 再根据文献支持和数据预测寻找并确定结合在该启动子区域的转录因子CEBP (CCAAT Enhancer Binding Proteins)qRT-PCR(Quantitative Real--Time··Polymerase Chain Reaction)方法检测CEBP对miR．6X表达的影响；利用染色质免疫共沉淀 万方数据 大连医科大学硕士学位论文技术检测CEBP是否募集到miR．6X启动子上并且这种募集是否受Herceptin影响； 大连医科大学硕士学位论文 技术检测CEBP是否募集到miR．6X启动子上并且这种募集是否受Herceptin影响； 采用RNA干扰技术，敲低CEBP，qRT—PCR方法探究miR．6X变化情况；利用 Western Blot检测miR．6X在蛋白水平对IGFlR(Insulin．1ike Growth Factor 1 Receptor)表达的影响；利用报告基因活性实验技术，研究miR．6X是否直接靶向 IGFlR；利用细胞耐药曲线和软琼脂形成实验，检测CEBP／miR．6X是否通过靶向 IGFlR增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性；Westem Blot检测CEBP／miR．6X是否 通过靶向IGFlR抑制pAKT／pERK(phosphorylation Protein Kinase B／phosphorylation Extracellular Signal．Regulated Kinase)通路；细胞耐药曲线、软琼脂形成实验和 Westem Blot检测CEBP增加乳腺癌细胞对Herceptin敏感性是否通过miR．6X，另 外也利用上述技术检测CEBP、miR．6X两者是否都通过pERK／pAKT通路增加 Herceptin敏感性；活体成像和HE(Hematoxylin and Eosin)染色检测miR．6X在体 内对乳腺癌肺转移的影响；RNA原位杂交、免疫组织化学和统计学分析检测CEBP、 miR．6X和IGFlR在乳腺癌中表达情况以及两两之间的相关关系；