H1299细胞热损伤后DNA双链断裂延迟性形成及其机初探-肿瘤学专业毕业论文.docx

硕士学位论文2、方法 硕士学位论文 2、方法 (1)H1299细胞45℃孵箱加热所需时间及S期同步条件的探索 本研究加热温度选择进行高热治疗的中间温度45℃，加热时间采用平板克 隆形成实验确定：取对数生长期的H1299细胞重新铺板并培养24h待细胞贴壁 牢固后用45℃预热的孵箱按实验分组分别热处理Oh、O．5h、lh、1．5h、2h、2．5h， 之后恢复正常温度继续培养14天，最后染色、计数、分析实验结果。因克隆形 成率太高说明热损伤可能未形成，克隆形成率太低不能保证后续实验的顺利进 行，所以取克隆形成率接近50％的加热时间为本研究最终采用的热处理时间。 为探讨S期细胞热损伤敏感的原因，研究采用血清饥饿法将H1299细胞同步至 S期，饥饿时间参考文献报道的28h(6J，然后采用流式细胞术确定H1299细胞无 血清培养后还需继续正常培养多少时间达到S期同步效果最大化。 (2)S期H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成及其对细胞存活能力的影响 按照上述实验获得的S期同步条件及热损伤条件获得同步至S期的H1299 细胞进行热处理，再根据实验分组收集细胞应用中性单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)实验动态检测热损伤后不同时间点细胞内的“彗星拖 尾”情况并用CASP软件定量分析DNA双链断裂程度。最后用台盼蓝拒染实验 检测S期H1299细胞热损伤后的存活率，结合中性单细胞凝胶电泳实验及台盼 蓝拒染实验的结果分析DNA双链断裂与细胞死亡的关系。 (3)H1299一细胞热损伤后一DNA双链断裂形成的可能机制 综合分析目前已发表的研究成果，我们推测热损伤后S期细胞内DNA双 链断裂形成的可能机制为细胞受热后形成的某些DNA碱基损伤在未得以修复 的情况下使周期阻滞在S期并继续指导复制进而形成DSB。因S期细胞内DNA 损伤主要由复制后修复途径修复，于是我们利用蛋白免疫印迹实验(Western blot，WB)检测H1299细胞热损伤后细胞核内复制后修复途径跨损伤合成通路 中的相关蛋白与DNA的结合情况(如Radl8及其下游ub—PCNA蛋白)判断复 制后修复途径是否受抑，并用流式细胞术动态观察热损伤后细胞周期变化情况 III 万方数据 摘要再结合s期阻滞相关蛋白p-ATM与DNA的结合情况以及EdU掺入实验分析热 摘要 再结合s期阻滞相关蛋白p-ATM与DNA的结合情况以及EdU掺入实验分析热 损伤后是否发生了S期阻滞以及阻滞期间DNA复制是否仍在进行。 3、结果 (1)H1299细胞45℃孵箱加热所需时间及S期同步条件的探索 H1299细胞经45℃孵箱热处理0h、0．5h、1h、1．5h、2h、2．5h后克隆形成 率分别为100％、67．87％、43．73％、30．09％、21．29％、7．79％，由此可知45℃ 孵箱加热1h为H1299细胞热损伤形成的较好条件。将H1299细胞进行无血清 培养28h后恢复10％胎牛血清继续培养，收集不同时间点的细胞利用流式细胞 术检测细胞周期的结果显示饥饿培养28h后恢复完全培养基继续培养1 8h可有 效使细胞同步至S期，其比例可达69．270／硅0．81％；而未经饥饿的细胞S期比例 持续在27．24％4-1．75％的低水平。 (2)S期H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成及其对细胞存活的影响 按照上述探索的周期同步条件及热损伤条件得到S期H1299细胞后进行热 损伤(45℃xlh)处理，然后应用中性SCGE实验动态检测热损伤后不同时间点 细胞内DNA双链断裂程度，结果提示S期H1299细胞热损伤后即刻至2．5h前 均无明显的“彗星拖尾”现象，其Olive尾力矩(Olive Tail Moment，OTM值) 与对照组亦无统计学差异；热损伤后5h开始出现明显的“慧星拖尾”现象(OTM 值与对照组有统计学差异，P0．05)。台盼蓝拒染实验分析S期H1299细胞热 损伤后细胞死亡率的结果显示S期细胞热损伤后7．5h内死亡率保持较低水平 (与对照组无统计学意义)，7．5h后死亡细胞急剧增多，至12．5h时细胞死亡 率达78．72％4-2．07％。 (3)H1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成的可能机制 Western Blot结果显示H1299细胞经热损伤后细胞核内与DNA结合的参与 DNA损伤复制后修复途径的Radl 8蛋白较未加热组显著减少，并随着热损伤后 恢复正常培养时间的延长呈逐渐降低的趋势；其下游蛋白ub．PCNA较未加热组 亦减少，但呈先降后升的趋势。感受DNA损伤并激活细胞周期检查位点通路 IV 万方数据 硕士学位论文的p-ATM蛋白在未加热组细胞内与DNA无结合，而加热组细胞内与DNA结 硕士学位论文 的p-ATM蛋白在未加热组