hBMP2和FGF2双基因共转染人骨髓基干细胞对其增殖及成骨分化的影响.docx

广东医学院 硕士学位论文 hBMP-2和FGF-2双基因共转染人骨髓基质干细胞对其增殖及成骨 分化的影响 姓名：王辉 申请学位级别：硕士 专业：@ 指导教师：郭伟韬 201005 hBMP-2和hFGF．2双基因共转染人骨髓基质干细胞对 其增殖及成骨分化的影响 中文摘要 【目的】 用人骨形成蛋白-2(hBMP一2)和人成纤维细胞生长因子．2邮GF．2)共表达腺病 毒载体(Ad．hBMP2．II也S郴GF2)感染入骨髓基质干细胞(11BMSCs)，研究其对 hBMSCs活性、增殖和成骨分化的影响。 【方法】 按lO、30、50感染复数(瑚m印lici够of in】毓tion，MOD的感染量，分别把 Ad-bBMP2．IRES心(求2和Ad．EGFP病毒液稀释到配制好的培养基中，按空白对 照组0lBMSC空白细胞)、阴性对照组(ⅫIMSC细胞感染Ad．EGFP)、阳性对照 组(hBMses细胞感染Ad．AMP2．Ⅱ通s．FG娩)分组感染入骨髓基质干细胞 (1lBMSCs)，荧光显微镜观察感染效果，确定最佳感染量。按最佳感染量如上述 分组转染hBMSCs，pCR分析目的基因的表达，Wrest锄B10t分析目的蛋白的表 达，CCK8、台盼蓝染色、流式细胞仪检测细胞增殖、活性及细胞周期，了解目 的基因的表达情况及感染对墟MSes活性及增殖的影响；ELASA检测l型胶原、 茜素红及von kos豫染色了解细胞矿化情况，以判断其成骨分化情况。 【结果】 (1)重组腺病毒以不同的MOI去感染细胞，在48小时后荧光显微镜下观察 细胞，可见MOI-lO时细胞感染率为80％左右，当MOI=30时，细胞感染率已达 到90％，MOI=50时，细胞感染数下降。 (2)PCR检测显示感染后试验组在468bp和183bp处出现明亮条带，而空白 对照组和阴性对照组在该位置出现的条带弱阳性或未见条带。Wrester b10t检测显 示实验组有相对分子质量(蚴约为14 Ooo的hB御一2蛋白条带和尬约为18 000 的ilFGF．2蛋白条带，阴性对照组和空白对照组为弱阳性条带。ee酗检测结果 l  显示：与未感染组比较，空载体感染组OD值低于未感染组，而目的基因共感染 组的OD值明显高于未感染组。台盼蓝染色空白对照组邮MSCs空白细胞)、阴 性对照组(hBMSCs细胞感染Ad-EGFP)、实验组(hBMSCs细胞感染 Ad-BMP2．IRES．FG．F2)存活率分别为99．8％、99．1％、98．9％，户0：酊，统计分析 无差异。细胞流式细胞仪检测，实验组、空白对照组、阴性对照组细胞增殖指数 0∞lifa哦i∞ind懿)】PrI=S％+G2M％分别为17．47％、9．92％、6．10％，统计分析 有显著差异，说明hBMP．2和hF(港．2双基因共感染对BMSCs细胞有明显的影 响，即增殖期细胞比例明显增加，能促进细胞增殖。 (3)ELASA检测试验组I型胶原含量在早期(3-7天)明显高于未感染组及空 载体感染组。目的基因共感染组llBMSC融合后继续培养，形成细胞结节，中心 出现基质沉积，茜素红染色显示明显钙结节，而未感染组及空载体感染组则无明 显钙结节形成。von kos黼染色第七天时就开始为阳性，黑色沉着物分布于细胞 外基质中，呈网状，第十四天时明显增多。 【结论】 l Ad．hBMP2．琢里S蝴GF2感染hBMSCs能够将目的基因有效导入细胞并高 表达。 2 hBMP-2和hFGF．2基因联合修饰hBMSCs对hBMSCs的活性没有负性影 响，可以有效促进其增值。 3 hBMP．2和hFGF．2基因联合修饰lIBMSCs能够有效促进其成骨分化。 【关键词】 腺病毒；骨形成蛋白．2；成纤维细胞生长因子-2：骨髓基质干细胞；基因 转染；成骨分化 2  ProIiferation and osteogenic di霸I．erentiation Eff．ec幻of inf＆tion with adenovirus vector co—exp rj鹪sing hBMP—2 and hFG】日．-2 genes on human bone mar—叫ⅣstI·omal ceHs in vitIⅪ The ad髓汹vect‘璐co吒xp聆sSjng脚-2锄d hFGF-2剿w哪in|Kted hno h咖b0鹏删咖lr str锄lal翻ls邮MSCs)ill、，i．们，which in鲫恸t0 stl：Idy thc vec衙e丘跃魑on the cells activi劬p∞lif砌on锄d osteogcnic di饪醯即．t黼。乱 【Methods】 Ad·BMP2·IRES·F(}F2锄d Ad·EGF