HIF1α在骨肉瘤中的表达及SA抑癌作用机制的研究.docx

D issertation subm itted to ShanghaiJiao Tong U niversity for the degree ofD octor ofPhilosophy O V E R E X PR E SSIO N O F H IF -1αIN O ST E O SA R C O M A A N D M E C H A N ISM O F T SA A N T IT U M O R IN V IT R O PhD Student: Yang Qing-cheng Supervisor: Professor Zeng Bing-fang Date: 2007.05 Shanghai Jiao Tong University Medical College 2007  HIF- 1α在骨肉瘤中的表达及 TSA 抑癌 作用机制的研究 摘 要 目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达在骨肉瘤侵袭、 转移中的作用以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑霉素 A（trichost- atin A，TSA）体外抗 骨肉瘤的活性及作用机制，为骨肉 瘤的治疗提 供一条新的途径和策略。 方法 1. 免疫组化法检测 HIF-1 α在骨肉瘤组织中的表达及与 临床病 理学参数的关系。 收集 39 例具有完整随访资料的骨肉瘤患者的组织石蜡标本及部 分瘤旁组织，通过免疫组化方法检测 HIF-1α、VEGF 和 MVD 在骨肉瘤 组织中的表达，将表达结果与患者的临床病理学参数进行统计分析； 取 15 例 新鲜骨 肉瘤 组织标 本， 通过 RT-PCR 的方法 ，检 测组织 中 HIF-1α 及 VEG F 的 mRNA 表 达 。从 中 了 解 HIF-1α 表 达 与 血 管 生 成 的 关系及其在预后预测中的意义。 2. 体外细胞培养研究 TSA 对骨肉瘤 MG-63 细胞增殖、凋亡、细 胞周期及侵袭性的影响。 体外培养骨肉瘤 MG-63 细胞，用 TSA 处理，通过直接镜观、MTT、  流式细胞仪、Annexin V 、TUNEL、电镜及 Transwell 法等手段，了 解 TSA 对骨肉瘤细胞的形态、增殖、细胞周期、凋亡及侵袭性的影响， 探讨其体外抗骨肉瘤的活性。 3. 体外细胞培养低氧诱导骨肉瘤 MG-63 细胞 HIF-1α 的 mRNA 及 蛋白表达，以及 TSA 对其表达的影响。 体外细胞培养骨肉瘤 MG-63 细胞株，去铁胺（desferrioxamine， DFX）模拟低氧环境，采用 RT-PCR、Western blotting、ELISA 等方 法，检测低氧诱导 MG-63 细胞 HIF-1α及其靶基因 VEGF 的 mRNA、蛋 白表达；同时给予 TSA 处理，了解低氧条件下 TSA 对骨肉瘤 MG-63 细 胞 HIF-1α表达的影响以及 TSA 抗肿瘤血管生成的作用。从低氧诱导 HIF-1α表达及血管生成角度探讨骨肉瘤的侵袭、转移机制。 结 果 1. 骨 肉 瘤 组 织 中 HIF-1a 阳 性 表 达 主 要 定 位 于 细 胞 核 ， 着 色 呈 棕 黄色颗粒。HIF-1a 在骨肉瘤组织中过表达。39 例骨肉瘤中，阴性表 达 8 例（20.5％），弱阳性表达 14 例（35.9％）,中等阳性表达 9 例 （23.1％），强阳性表达 8 例（20.5％），总阳性表达率 79.5％， 与 瘤旁非肿瘤组织比较差 异具有显著意义（P0.05 ）。HIF-1a 在骨 肉瘤组织内部以及坏死区域的周围、远离血管区等明显缺氧区域表达 明显，提示 HIF-1a 的表达与组织低氧密切相关。VEGF 阳性表达主要 定位于肿瘤细胞的细胞质及 细胞膜上。39 例骨肉瘤中， 阴性表达 4 例（10.3％），弱阳性表达 16 例（41％）,中等阳性表达 11 例（28.2 ％），强阳性表达 8 例（20.5％），总阳性表达率 89.7％，与瘤旁  组织相比，两者差异具有显著意义（P0.05）。39 例骨肉瘤组织， MVD 平 均 计 数 为 2 9.92±5.2 ， 明 显 高 于 瘤 旁 组 织 12.41±3.7 （P0.05）。 连续切片显示 HIF-1a、VEGF、CD31 三者在骨肉瘤组织中的表达 区域基本一致。Spearman 相关分析表明 HIF-1a、VEGF 的阳性表达与 MVD 正相关。提示 HIF-1a 阳性表达与肿瘤血管的形成密切相关。 H IF-1a 的过表 达与肿 瘤分期 (ⅡA VS ⅡB/Ⅲ) 及肿瘤 坏死率 (＜ 90% VS ≥90%）显著相关，具有统计学意义（P0.05）。单因素统计 分析