COPD人肺成纤维细胞IL6 IL8 弹蛋白的生成及其炎症调节的研究.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 博士学位论文 中文摘要 摘 要 中文摘要 【目的】 成纤维细胞是肺的重要结构细胞，并在肺组织破坏后的修复和／或重构中起着 重要作用。近年来认为成纤维细胞也参与炎症反应，例如成纤维细胞在风湿性关 节炎等疾病中参与局部炎症反应网络的调控。目前关于肺成纤维细胞炎症反应和 修复功能关系的相关研究较少。为此，本研究拟评价慢性阻塞性肺疾病(COPD) 患者肺成纤维细胞炎症因子水平、增殖能力和弹性蛋白合成的情况；在此基础上 深入探讨脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子．0‘(TNF．伐)、凋亡细胞、坏死细胞等常 见炎症刺激对人肺成纤维细胞分泌细胞因子和增殖功能的影响，并观察低剂量茶 碱的调节作用。 【方法】 (1)从因肺癌等手术切除标本的正常肺组织中分离培养原代人肺成纤维细胞，建 立细胞株库，取第2、3代细胞进行进一步实验和检测。所有组织及其应用 按照伦理学要求获取知情同意签字后实施。根据术前肺功能将研究对象分为 非COPD、COPD I～ⅡI级。通过对照研究评价COPD患者肺成纤维细胞白 介素(IL)．6和IL．8的mRNA和蛋白水平、增殖能力以及弹性蛋白合成。 (2)将人肺成纤维细胞分别和1I．tg／ml LPS、lng／ml TNF一0【、凋亡细胞或坏死细胞 共培养24h后收集培养液上清，并裂解细胞提取RNA保存备测。 (3)在人肺成纤维细胞培养中加入凋亡细胞或坏死细胞，通过多重免疫荧光染色 共聚焦显像分析肺成纤维细胞的吞噬功能。 (4)采用逆转录实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测IL．6、IL．8、组蛋白去 乙酰基酶2(HDAC2)和弹性蛋白的mRNA转录水平。 (5)使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液上清中的TNF．0c、IL．6、转 化生长因子(TGF)．131、TGF-p2、TGF．p3、IL一8、IL一12p70、IL一1p以及 IL．10。 (6)使用Fastin Elastin Assay定量检测弹性蛋白浓度。 (7)用AlamarBlue⑩(AB)法检测LPS、TNF．0L、IL．8、IL．6以及经LPS预处 理的巨噬细胞条件培养液对人肺成纤维细胞增殖的影响。 (8)检测低剂量茶碱(5¨g／mD对LPS引起的肺成纤维细胞IL．6、IL．8分泌、 HDAC2 mRNA转录以及增殖能力的影响。 (9)用GraphPad Prism 5．0 for Windows进行统计学分析。符合正态分布的数据以 平均值4-标准差表示；未通过正态分布检验的数据以中位数(最小值，最大  博士学位论文 中文摘要 值)表示，其中部分增殖实验结果以中位数(25％四分位数，75％四分位数) 表示。根据是否正态分布以及统计分析类型选择相应的统计学方法。P0．05 为有显著性差异。 【结果】 (1)分离得到的原代细胞在显微镜下具有成纤维细胞的典型形态，细胞免疫荧光 染色显示99％以上的细胞表达波形蛋白；而细胞角蛋白、von Willebrand因 子、结蛋白染色阴性则证明无上皮细胞、间皮细胞、内皮细胞或平滑肌细胞 混杂，说明原代分离的人肺成纤维细胞纯度高。 (2)在COPD人肺成纤维细胞研究部分，根据肺功能情况分为COPD S组(包括 GOLDII、Ⅲ级)和对照组(包括非COPD和GOLD I级)，两组在年龄、 性别、吸烟史方面无显著性差异。COPDs组(12例)和对照组(10例)FEVl 占预计值％分别为(59．8：t：9．5)％和(92．3+8．4)％，FEVl／FVC％分别为 (54．9士8．3)％和(73．64-10．8)％，P值均0．001。 (3)qRT-PCR显示COPDs组人肺成纤维细胞IL．6和IL．8的mRNA转录均显著 高于对照组，与之相对应的，其蛋白分泌量也明显升高，分别为(701．6+288．0) pg／ml VS (355．74-330．8)pg／ml(P=0．02)和(754．34-297．4)pg／ml VS (373．4+243．1)pg枷(仁0．02)。IL．6、IL．8的转录及分泌水平和FEVl占 预计值％和FEVl／FVC％均呈负相关。 (4)COPDs组人肺成纤维细胞体外增殖能力弱于对照组(1．184-0．32 VS 1．634-0．22，P=-0．004)。 (5)COPDs组人肺成纤维细胞弹性蛋白mRNA代偿性表达升高[6．194(3．118， 33．000)VS 2．241(O．916，22．140)，P=-0．0276]，伴随可溶性弹性蛋白升高 【(26．404．6．50)pgM vs(15．00a：3．90)pg／nfl，P=0．001)】，但是不可溶性弹 性蛋白无差别。 (6)在1 I_tg／ml LPS刺激24h后人