CpxAR双组份系统在副猪嗜血杆菌应对刺激中的用研究.docx

分类号 分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 CpxA／R双组份系统在副猪嗜血杆菌应对刺激中 的作用研究 The role of CpxA／R two--component system in stress response of Haemophilus parasuis 研 究 生： 冯芬芬 学 号： 2012302110136 指导教师： 蔡旭旺副教授 指导小组： 蔡旭旺副教授 徐晓娟副教授 王湘如讲师 专业：预防兽医学 研究方向：动物传染病 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2015年6月 华中农业大学动物医学院 二O一五年六月 万方数据 本研究得到国家重点基础研究发展计划(973计划) 本研究得到国家重点基础研究发展 计划(973计划) (No．20 1 2CB5 1 8 800)资助 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否必威体育官网网址 界忉 如需必威体育官网网址，解密时间 年 月 日 咖圳㈣㈣㈣哪I 独创性声明 Y2803825 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：7刁焉海 时间： 硼fs年 ‘月 ，【日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：必威体育官网网址学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交必威体育官网网址的论 文)在解密后适用于本授权书． 学位论文作者签名：7马奄器 导师签名： 渺 签名日期：加fS年∥月Ⅸ日签名日期：≯，妒年6月f厂日 万方数据 副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统对其环境适应能力和毒力的调控目 副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统对其环境适应能力和毒力的调控 目 录 摘要 ．i Abstract ．iii 缩略词表(Abbreviation) v 1．文献综述 1 1．1副猪嗜血杆菌研究进展 1 1．1．1副猪嗜血杆菌病概述 1 1．1．2副猪嗜血杆菌耐药性和致病机制研究进展 1 1．2 Cpx双组份调控系统研究进展 3 1．2．1 Cpx双组份调控系统概述 ．3 1．2．2 Cpx双组份调控系统的激活 ．5 1．2．3 Cpx双组份系统对细菌耐药性的调控 ．5 1．2．4 Cpx双组份系统对细菌毒力的调控 ．7 2研究目的与意义 ．8 3材料和方法 ．9 3．1实验材料 9 3．1．1菌株、质粒载体和细胞 9 3．1．2酶、试剂、试剂盒 9 3．1．3主要细菌培养基及抗生素的配制 ．10 3．1．4琼脂糖凝胶电泳相关溶液 ．10 3．1．5引物 1 1 3．2实验方法 ．13 3．2．1副猪嗜血杆菌基因组DNA的提取 13 3．2．2副猪嗜血杆菌基因组RNA的提取及反转为eDNA 14 3．2．3重组自杀性质粒的构建 ．14 3．2．4自然转化筛选基因缺失突变株JS0135-Acpx,4、JS0135-AcpxR和 JS0135一AcpxAR ． ． ． ． ． ． ．． ． ． ． ． ． ． ． ． 17 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文3．2．5 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 3．2．5 RT-PCR验证基因缺失和极性效应检测 17 3．2．6细菌生长曲线的测定 ．．17 3．2．7药物敏感性实验 。1 8 3．2．8菌株生物被膜形成能力测定 ．．18 3．2．9应激耐受实验 ．．19 3．2．10 OD600值和活菌数对应关系的测定 19 3．2．11 PK-15细胞粘附实验 一19 3．2．12吞噬实验 20 3．2．13荧光定量实验 21 3．2．14 CpxR蛋白的诱导和表达 22 4．结果和分析 ．25 4．1自然转化法筛选基因缺失突变株 ．．25 4．1．1重组自杀性质粒的构建及鉴定 25 4．1．2 Cpx基因缺失突变株的筛选和PCR鉴定 ．．26 4．2 RT-PCR验证基因缺失及检测极性效应 29 4．3 Cpx基因缺失株测序 一30 4．4细菌生