cRGD通过下调uPA蛋白及逆转EMT抑制卵巢癌血管成拟态形成-妇产科学专业毕业论文.docx

硕士学位论文第一章uPA对卵巢癌血管生成拟态形成的影响 硕士学位论文 第一章uPA对卵巢癌血管生成拟态形成的影响 目的 旨在从组织水平及细胞水平深入探究uPA蛋白对卵巢癌血管生成拟态形成 的作用及其可能的分子机制，这对丰富完善肿瘤血管生成拟态理论有重要的意 义，同时为临床上卵巢癌抗血管生成治疗提供靶点。 方法 1．卵巢癌组织水平上探究uPA蛋白与卵巢癌血管生成拟态的关系 首先对前期试验中收集来自广州珠江医院病理科的90例经手术切除的卵巢 癌组织进行uPA蛋白免疫组织化学染色及CD34．PAS双重染色。统计分析uPA 蛋白表达、血管生成拟态结构与临床数据的关系及uPA蛋白表达与血管生成拟 态结构的关系。 2．体外三维培养比较不同卵巢癌细胞形成血管生成拟态的能力 150乩基质胶加入24孔细胞培养板中，在37 oC孵箱中静置45 min，收集 生长处于对数期的SKOV-3、OVCAR-3、A2780和HUVEC细胞以3．5×105个／ 孔的细胞密度加入到基质胶表面放入37 oC细胞孵箱中孵育8 h，倒置显微镜观 察VM管腔结构形成情况。 3．Western Blot检测各种卵巢癌细胞uPA蛋白表达水平 分别提取SKOV一3、OVCAR-3和A2780卵巢癌细胞的蛋白样品，用BCA 法进行蛋白定量。计算50 pg蛋白的溶液体积即为上样量，SDS电泳，转 到PVDF膜上，5％BSA溶液进行封闭，孵育uPA一抗40C过夜，次日洗膜， 孵育二抗后进行曝光。选用GAPDH作为内源性对照。 4．细胞瞬时转染及RT．PCR和Western Blot检测转染后uPA表达水平 待铺至6孔板中的SKOV．3和OVCAR．3细胞融合至70％～80％，取uPA 干扰片段(si—RNA)及其阴性对照组片段(si—NC)各100 pmoL分别与脂质体 lipofectamin 2000 5止混合，并按照按lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明书 进行转染。 III 万方数据 摘要分别提取被转染48／72 摘要 分别提取被转染48／72 h的SKOV．3和OVCAR-3细胞si．RNA和si．NC组中 的RNA和蛋白运用RT．PCR和Western Blot检测uPA RNA和蛋白的表达情况。 5．体外三维培养检测下调uPA蛋白表达对卵巢癌细胞血管生成拟态形成能力 的影响 用已被成功下调uPA蛋白表达的SKOV．3和OVCAR．3细胞si-RNA和si-NC 组细胞进行体外三维培养，比较干扰uPA蛋白表达前后两种卵巢癌细胞形成血 管生成拟态能力的变化。 6．Western Blot检测下调uPA蛋白表达对卵巢癌血管生成拟态相关基因表达的 影响 分别提取已被成功下调uPA蛋白表达的SKOV．3和OVCAR-3细胞si．RNA 和si-NC组细胞的蛋白，Western Blot检测uPA、AKT、p-AKT、mTOR、P-mTOR、 MMP．2和Laminin5T2蛋白的表达情况。选用GAPDH作为内源性对照。 结果 1．VM结构、uPA蛋白表达与临床资料的关系 免疫组化发现90例卵巢癌组织标本中uPA蛋白表达水平不同。根据免疫组 化中阳性细胞率联合染色强度的评分法则将卵巢癌组织分成uPA(．／+)、uPA (++)和uPA(++十)三组。将uPA(一)和uPA(+)定义为低表达，将uPA(++) 和uPA(+++)定义为高表达。我们发现在早期和晚期卵巢癌组织中uPA蛋白 高表达率分别为36％和82．5％，差异有统计学意义(尸=0．000)。在低分化、中 分化、高分化的卵巢癌中uPA蛋白高表达率分别为77．3％、41．6％和59．4％， 差异有统计学意义(尸=0．028)。CD34．PAS双染结果发现，某些组织中出现VM 结构(表现为PAS阳性，CD34阴性的管腔结构，这些管腔结构由肿瘤细胞和细 胞外基质构成，其内偶见红细胞)阳性率为40％(36／90)。在早期和晚期卵巢 癌组织中VM阳性率分别为26％和57．5％，差异有统计学意(P=0．003)。在 低分化、中分化、高分化的卵巢癌中uPA蛋白高水平表达率分别为64％、53％ 和14％，差异有统计学意义(产0．000) IV 万方数据 硕士学位论文2．uPA蛋白与VM在卵巢癌组织中的关系 硕士学位论文 2．uPA蛋白与VM在卵巢癌组织中的关系 从uPA在VM阳性卵巢癌组织中表达情况和VM在uPA蛋白不同的组织中 阳性率两方面进一步分析卵巢癌组织中uPA蛋白表达与VM的关系。我们发现 VM在uPA(一／+)、uPA(++)和uPA(+++)三组中出现的阳性率分别为18．1 ％、41．7％和57，1％。uPA蛋白在VM阳性组中高表达：22．2％uPA(．／+)、30．5 ％uPA(++)和4