HVJE免疫佐剂的特分析.docx

王珍：HVJ，E免疫佐剂的特性研究 王珍：HVJ，E免疫佐剂的特性研究 l HVJ-E 免疫佐剂的特性研零 一 研究生：王珍 导师：徐向明教授 摘要 新城疫和禽流感是全球禽类重要的传染性疾病，如不采取严格、有效的控制 措施，可迅速引起动物发病和死亡，给养禽业造成重大经济损失。目前这两种疾 病可通过疫苗接种来预防和控制。但常用的灭活苗佐剂(如油乳和铝盐)通常会 引起较强的局部反应，包括疼痛、炎症等，或不能增强抗原的免疫原性。因此， 需要研究和开发新型、高效、低毒的免疫佐剂。 日本血凝病毒(Hemagglutinating virus ofJapan,HVJ)亦称仙台病毒，是一种 具有血凝性和高效膜融合功能的包膜病毒，经紫外线灭活失去感染性的病毒囊膜 (Hemagglutinating vires ofJapan Envelope，I-IVJ—E)具有双重的免疫调节作用，可 以同时促进先天性免疫反应和获得性免疫反应。许多研究证明，HVJ．E可刺激树 突状细胞(Dendritic cell，DC)成熟，并刺激DC产生IFNs和IL．6等细胞因子， 其中IL．6能抑制调节性T细胞的活化，促进效应性T细胞和NK细胞的产生，阻 止IL．10、TGF等免疫抑制性细胞因子的分泌，具有明显的免疫增强作用。但HVJ—E 直接作为免疫佐剂的研究尚未见报道，因此，本研究通过将HVJ．E分别与新城疫 或禽流感H9N2灭活苗共同免疫，从抗体产生水平，细胞因子激发水平和经病毒 攻击后的保护水平三个方面来研究HVJ．E的免疫佐剂特性。研究主要从以下三个 方面进行探讨： (1)HvJ．E诱导小鼠骨髓树突状细胞成熟的研究：体外分离培养C57BL／6小 鼠骨髓树突状细胞(murine marrow-derived dendritic cell，mDC)，清洗细胞悬液， 离心取细胞沉淀(2x106)铺6孔板，并加50 rig／mY鼠重组GM．CSF和IL．4，5 d 后弃去悬浮细胞，收集半贴壁的未成熟的树突状细胞。DC经HVJ．E刺激48 h后， ELISA检测各组DC上清中细胞因子的分泌水平，流式细胞仪测定DC细胞表面分 2 2 扬州人学硕十学位论文 子的表达率。ELISA检测结果显示，相对于PBS刺激组，经HVJ．E刺激后DC所 分泌的IFN．13、IL．6、TNF．0L和IFN吖的表达水平显著升高；流式细胞仪分析显示 HVJ．E刺激的DC引起细胞表面的共刺激分子CD40、CD80、MHC II和CDl lc也 呈现较高水平表达；研究结果充分说明了HVJ—E可以刺激小鼠树突状细胞的成熟 化和细胞因子的分泌。 (2)HVJ．E作为新城疫灭活苗免疫佐剂的研究：将SPF鸡随机分为四组，每 组20只，分别为灭活苗(KV)组、HVJ．E(1．5x109)+KV组、HVJ．E(1。5x109)组和 PBS组。分别于免疫后7 d、14 d、21 d翅静脉采血，分离血清并测定抗体水平； 免疫后21 d以ND强毒进行攻毒，攻毒后2 d、4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖 腔棉拭子，接种SPF鸡胚，分离病毒；统计分析HVJ．E对ND灭活苗的免疫促进 作用。结果显示，HVJ．E+KV组的抗体水平较灭活苗(KV)组显著提高(pO．05)； 攻毒结果显示，HVJ．E+KV组能使被免疫鸡完全保护且没有排毒。研究结果提示， HVJ．E可以作为NDV灭活苗的免疫佐剂。 (3)HVJ．E作为禽流感H9亚型灭活苗免疫佐剂的研究：将SPF鸡随机分为 四组免疫，分组及免疫方式同前。免疫后7 d、14 d、21 d采血，分离血清，测定 抗体水平和细胞因子水平；免疫后14 d、21 d，分离淋巴细胞，提取RNA，半定 量RT-PCR检测IFN吖和IFN．13的表达水平；免疫后21 d鼻内攻毒，攻毒后2 d、 4 d、7 d、10 d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子，接种SPF鸡胚，分离病毒；统计分析 HVJ．E对H9灭活苗的免疫促进作用。结果显示，免疫后7 d，HVJ—E+KV组和KV 组可检测到特异性抗体，但两组间没有明显差异；免疫后14 d和21 d，HVJ．E+KV 组比KV组的抗体水平要高，且差异显著(p0．05)：HVJ．E组和HVJ．E+KV组细 胞因子的mRNA表达水平比PBS组和KV组的高；攻毒结果显示，PBS组的阳性 分离率要比其他组高(p0．05)，且各组都没有死亡，HVJ．E+KV组比KV组的病 毒分离率降低(po．05)，HVJ．E+KV组免疫鸡完全受到保护。以上结果表明HVJ．E 能够刺激机体产生更好的免疫保护，可作为灭活苗的免疫佐剂。 关键词：日本血凝病毒囊