Crizotinib诱导肺癌细胞保护性自噬及其机制研-肿瘤学专业毕业论文.docx

浙江大学博士学位论文 致谢 致 谢 3年的博士生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，论文完成之日， 心中无限感激不知从何说起，首先我想要向所有指导和帮助过我的老师和同学， 所有关心和支持我的朋友和家人，致以衷心感谢! 首先诚挚的感谢我的导师潘宏铭教授，本课题从选题、设计、实施到完成及 论文撰写，每一步都倾注着导师的心血。您以深邃活跃的学术观点，创新求是的 科研精神，严谨的工作作风、渊博的学识和一丝不苟的治学态度、为我树立了学 习的典范。您的教诲将激励我在科研和临床的道路上努力学习，永不放弃。 衷心地感谢浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科韩卫东副研究员。在我 实验研究中，您的悉心指导和教诲，使我接受了全新的思想观念，领会了科学的 思考方式，掌握了通用的研究方法，树立了明确的研究目标。 衷心地感谢潘勤博士、谢建胜博士，他???在科研选题、课题设计、实验开展 以及论文撰写等各个方面，给予我的指导和无私帮助。 衷心地感谢浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科方勇主任医师、王娴主 任医师、楼海舟主任医师、王凯峰副主任医师、李达副主任医师，感谢他们在临 床工作中对我的关心和帮助。 衷心感谢王章桂、寿佳威、景钊、姚君琳、江黎明等。非常高兴能与他们一 起学习和工作，共同度过了这段难忘的时光。 衷心感谢我的爱人、父母在生活和精神上一如既往的支持、鼓励和奉献，他 们的付出使我得以心无旁骛、专心求学。 再一次感谢所有曾给予我帮助和关心的老师、同学、亲人和朋友们。 最后，谨向百忙之中抽出时间参加论文评阅和答辩的专家、教授致以最诚挚 的敬意。 游良琨 2015年5月 万方数据  浙江大学博士学位论文 中文摘要 Crizotinib诱导肺癌细胞保护性自噬及其机制研究 浙江大学医学部 肿瘤学 博士研究生 游良琨 导 师 潘宏铭教授 中文摘要 Crizotinib是靶向MET、ALK融合基因和ROSl的多靶点受体酪氨酸激酶抑制 剂。Crizotinib作为MET抑制剂被研发，但首先被FDA批准用于EML4。ALK融合 基因阳性的局部进展期及转移性肺腺癌的一线治疗，并同时建议用于存在MET基 因扩增的肺癌患者。然而同大多数分子靶向治疗药物类似，半数以上患者在初始 治疗1年内发生耐药，其原因包括原发性及获得性耐药突变，多种旁路癌基因的 激活等。作为细胞对外界刺激的一种应激性存活机制，自噬参与了多种肿瘤细胞 的耐药。常见的抗肿瘤治疗如化疗、放疗、生物靶向治疗等均可以引起肿瘤细胞 自噬。Crizotinib能否诱导肺癌细胞自噬发生，从而导致其耐药尚不清楚。 目的 研究Crizotinib对肺癌细胞自噬水平的影响及自噬在肺癌细胞耐药中所起的作 用；分析Crizotinib诱导自噬发生的具体分子机制；在此基础上观察抑制自噬是否 增加肺癌细胞对Crizotinib的敏感性。 方法 通过Westernblot、免疫荧光、透射电镜等方法观察Crizotinib处理后肺癌细胞 SPC．A1、A549、H2228中自噬相关蛋白表达情况及自噬体的形成；Western blot 分析Criztinib处理后肺癌细胞MET，STAT3，AKT／MTOR，ERK等信号通路关键 II 万方数据  浙江大学博士学位论文 11文摘要 分子的表达情况；采用MTS方法检测通过自噬抑制剂或下调自噬关键基因Beclinl 抑制自噬对Crizotinib抗肿瘤作用的影响；采用流式细胞仪定量分析药物处理后细 胞凋亡比率；建立肺癌裸鼠移植瘤模型评估自噬抑制剂对Crizotinib的增敏作用。 结果 Crizotinib能够抑制多种肺癌细胞株的活力，用Crizotinib处理表达MET的 SPC．A1细胞，表达EML4．ALK的H2228细胞，和同时具有MET表达和KRAS 突变的A549细胞，均可见细胞自噬水平的上升，表现为LC3 I向LC3 II转换增多； 免疫荧光显示LC3 II puncta增多及电镜下自噬体的增加等。 Crizotinib能够抑制MET及其下游STAT3、AKT／MTOR和ERK的磷酸化水平。 进一步的研究发现Crizotinib诱导肺癌细胞自噬主要是通过分阶段的抑制胞质及胞 核中的STAT3信号通路实现，胞质中STAT3的抑制导致EIF2AK2与其解离，继 而磷酸化EIF2A而诱导自噬增加，而胞核中STAT3的抑制导致其转录激活的BCL2 水平下降，进而促进自噬水平的持续增加。 体外研究表明使用自噬抑制剂或下调自噬关键基因Beclinl抑制自噬促进 Crizotinib对肺癌细胞的增殖抑制作用。不同浓度的Crizotinib联合