IL17刺激HSC分IL6及其在肝损伤 肝纤维化中作用的实验研究.docx

温州医学院博士学位论文中文摘要 温州医学院博士学位论文 中文摘要 IL．17刺激HSC分泌IL．6及其在肝损伤、肝纤维化中作用的 实验研究 ．屿!鱼 尉 吾 肝纤维化(1iver fibrosis)是肝脏对各种慢性损伤的愈合反应，表现为细胞外 基质的沉积和构成改变，最终进展为肝硬化(1iver cirrhosis)，是各种慢性肝病的 共同病理基础。肝纤维化及肝硬化是各种慢性肝病的终末阶段。慢性肝病中，由 于致伤因素的持续存在，“创伤．炎症．修复”的反复持续进行，致使正常肝脏向 肝纤维化、肝硬化不断进展。在此过程中，肝星状细胞(hepatic stellate cells， HSC)活化、增殖，分泌大量的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，是肝 纤维化、肝硬化时细胞外基质的主要来源，是肝纤维化的中心环节。正常情况下， HSC位于肝窦Diss间隙中，主要参与维生素A的代谢；当肝脏损伤时，HSC分 泌转化生长因子-Bl(transforming growth factor．Bl，TGF．B1)、血小板衍生生长 因子(platelet derived growth factor，PDGF)、成纤维细胞生长因子f fibroblast growth factor，FGF)、胰岛素样生长因子．1(insulin．1ike growth factor．1，IGF．1)、 血小板活化因子(platelet．activating factor，PAF)等生长因子及IL．6、IL．8、MCP．1 等细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式与肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞 以及血液中来源的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等相互作用，构成复杂的细 胞间相互作用和细胞因子作用网络，调节肝脏的炎症反应、细胞增殖和组织修复， 参与慢性肝病过程中“创伤．炎症．修复”的多个病理环节。其中，多效性细胞因 子IL．6，在肝纤维化进程中具有显著而重要的作用。研究表明，在急性肝炎、慢 性乙型肝炎及乙肝后肝硬化、慢性丙肝后肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、酒精性 肝病及原发性肝癌中均可见血清IL．6水平升高。IL．6与TNF．0【、IL．3、IL．4、IL．5、 IL．8等其他细胞因子有协同作用，促进肝脏炎症反应，使肝脏炎症持续存在，促 使肝纤维化形成。同时，IL．6能增加急性期反应蛋白物和抑制白蛋白的产生， 抑制金属蛋白酶(Matrix Metallo Proteinases，MMP)的产生，增加I型胶原及 组织金属蛋白酶抑制物(Tissue Inhibitor Matrix Metallo Proteinases，TIMP)的转 录，促进肝纤维化的形成。而且，活化的HSC产生大量IL．6，而IL．6通过自分 泌和旁分泌的方式刺激HSC活化、增殖和胶原合成，故IL．6也被视为HSC活 化的标志。 IL．17A是一种新发现的具有强大作用的免疫致病性的促炎因子，由Thl7细 温州医学院博士学位论文胞分泌，是IL．17细胞因子家族主要成员，通常称为IL．17。IL·17通过与细胞膜上 温州医学院博士学位论文 胞分泌，是IL．17细胞因子家族主要成员，通常称为IL．17。IL·17通过与细胞膜上 的IL．17RA结合，促进多种细胞因子和趋化因子的分泌，具有促炎、促凋亡和促 有丝分裂的作用。在炎症反应、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥等疾病中发挥 重要作用。最近研究报道IL．17在慢性乙肝、慢性丙肝、酒精性肝病、原发性胆 汁性肝硬化、肝癌等肝脏疾病中明显升高、并且与肝脏损伤的严重程度正相关。 研究表明IL．17通过刺激HSC分泌IL．8和GRO．0【等趋化因子，募集中性粒细胞诱导 肝脏炎症，在酒精性肝病中具有重要的作用。 但是，IL．17能否促进HSC分泌IL．6及其机制，以及它们与肝脏损伤、肝纤维 化的关系未见报道。我们利用慢病毒介导的IL．17RA shRNA，通过分离培养正常 大鼠HSC，分析IL．17刺激HSC分泌IL．6的作用机制；并通过人血白蛋白诱导大鼠 肝纤维化模型探讨IL．17／IL．6与肝损伤、肝纤维化的关系。希望为肝纤维化、肝 硬化的发病机制提供新的理论基础。 第一部分：大鼠肝星状细胞的分离和培养的实验研究 目的：建立稳定、高效、快捷的大鼠HSC分离和培养方法，以获得大鼠HSC， 为研究肝纤维化中细胞因子的作用机制提供靶细胞，为下一步实验奠定基础。 方法：体重为450．5509雄性SD大鼠15只，采用门静脉插管原位灌注和离体灌 注，0．5mg／mllV型胶原酶和0．03 mg／ml DNA酶I消化分散，使用16％Optiprep 液、8％Optiprep液和D．Hanks液构建密度梯度分离离心体系，分离出大鼠HSC